Google+ Followers

jueves, 25 de diciembre de 2014

BACTERIAS

BACTERIAS



Morfología y formas bacterianas:

las bacterias pueden presentar diversos tamaños y formas, pero existen tres formas básicas.

              esféricas (cocos)
              bastoncitos o cilíndricas (bacilos)
              helicoidales (espirilos)

Los cocos libres aparecen como  células esféricas aisladas. Pero después de una división  celular muchas bacterias no se separan totalmente, originando distintos agrupamientos.
Estos agrupamientos se denominan:
cocos en pares (diplococos), en cadena (estreptococos), en tetradas, en racimos (estafilococos), en cubos (sarcina).
Los bacilos si son cortos, se denominan cocobacilos.
Los bacilos bacterianos curvos en forma de coma se denominan vibrios y los levemente helicoidales en una curvatura, espiroquetas.

La mayor parte de las bacterias tienen una longitud media de 1 a 5 µm, aunque alguna pueden alcanzar de 30 hasta 300 µm.

                              

OBSERVACIÓN DE LOS MICROORGANISMOS


La morfología bacteriana se puede observar de dos maneras:

1.            en estado vivo
2.            muertas o coloreadas

Las bacterias en estado vivo son en general incoloras y carentes de contraste con el agua en donde se encuentran en suspensión como para ser vistas.
Es por esto que se usan colorantes que poseen afinidad por algún componente celular dando color a las diferentes partes celulares.

Todos los microorganismos, excepto los virus, pueden ser observados mediante microscopios ópticos, por lo que nos vamos a limitar a describir las técnicas más comúnmente usadas para realizar preparaciones para microscopios ópticos.

1.-           Preparación en estado vivo (o en fresco):
Para poder observar la movilidad de un microorganismo es preciso que no esté fijado. Consiste en suspender una gota, tomada directamente de la muestra, sobre un portaobjetos y cubriéndola, sin formar burbujas de aire, con un portaobjetos se observa al microscopio de contraste de fases.

2.- Técnicas de tinción o coloración:
En general, el proceso seguido en todas las tinciones conlleva las siguientes etapas: extensión, fijación, tratamiento con colorantes y observación.

1.- Extensión: se realiza sobre un portaobjetos que ha de estar totalmente limpio. Si la muestra es líquida se hace directamente y, si es sólida, hay que resuspenderla previamente en una gota de H2O.
2.- Fijación: tiene por objeto adherir la muestra al portaobjetos y desnaturalizar las proteínas para facilitar la acción del colorante. Normalmente se realiza con calor, pasando la muestra repetidamente a 10 cm de la llama del mechero.

La fijación de una extensión bacteriana es imprescindible para que las bacterias queden
inactivadas y adheridas al vidrio. De esta manera, no se pierden en los pasos de lavado
necesarios para la tinción. Se debe procurar, además, que este proceso altere lo menos posible
la morfología bacteriana.
Si las bacterias se encuentran resuspendidas en agua, la fijación puede hacerse por calentamiento
de la muestra sobre el portaobjetos. Es sumamente importante no excederse en este proceso para que
las bacterias no se deformen o se rompan.
La fijación de bacterias que se hallan en su propio medio de cultivo debe hacerse empleando un
procedimiento alternativo como la fijación con metanol. La fijación al calor no da en este caso buen resultado, pues la capa de materia orgánica que contiene las bacterias, una vez realizada la extensión, tiende a despegarse con facilidad en los lavados posteriores.

REALIZACIÓN
Preparación de un frotis bacteriano.
1. Colocar una pequeña gota de agua en un portaobjetos limpio.
2. Con el asa de siembra previamente flameada transferir una pequeña cantidad del cultivo bacteriano en medio sólido a la gota. Remover la mezcla hasta formar una suspensión homogénea y extenderla para facilitar su secado.
Nota: si el material de partida es un cultivo en medio liquido, no es necesario realizar estos dos primeros pasos. Basta con colocar y extender una muestra de la suspensión bacteriana directamente sobre el portaobjetos.
3. Esperar hasta que la fina película de líquido se evapore o bien acelerar este proceso con un ventilador o un secador. No eliminar el líquido calentando el portaobjetos a la llama, pues las células pueden deformarse o romperse.
4. Fijación de las bacterias al vidrio portaobjetos:

a) Por calor (bacterias procedentes de medio sólido). Pasar tres veces el portaobjetos por la llama durante unos segundos. Dejar enfriar el portaobjetos entre los pases.
b) Con metanol (bacterias procedentes de medio liquido). Añadir unas gotas de metanol sobre la extensión completamente seca. Retirar de inmediato el exceso de metanol del portaobjetos, golpeándolo por su canto con cuidado contra la mesa de trabajo. Esperar a que el metanol se evapore completamente.
Tinción simple:
5. Cubrir los frotis con abundante colorante, uno de ellos con cristal violeta y el otro con safranina. Dejar actuar los colorantes durante 2 min.
6. Lavar las preparaciones con agua para eliminar el exceso de colorante. Para ello, inclinar el portaobjetos y aplicar el chorro de agua en su parte superior permitiendo que resbale sobre el frotis. No dirigir el agua directamente sobre el frotis pues podría arrastrar parte de el consigo.
7. Eliminar la máxima cantidad de agua de los portaobjetos golpeándolos por su canto con cuidado contra la superficie de la mesa de trabajo.
8. Esperar hasta que el líquido se evapore. Este proceso se puede acelerar secando el portaobjetos por simple presión entre dos papeles de filtro (en ningún caso frotar el portaobjetos).
9. Observar la preparación al microscopio con el objetivo de inmersión. Seleccionar un buen campo de observación y dibujarlo ilustrando la morfología y agrupación de las bacterias.

3.- Tinción: se realiza añadiendo los colorantes sobre los microorganismos sometidos a los procesos anteriores. Puede ser de varios tipos:

Negativa: Los colorantes no tiñen el microorganismo, sino el entorno, aumentando de este modo su contraste. La muestra se extiende sobre una gota del colorante (nigrosina).
Simple: Se utiliza un solo colorante que puede ser de cualquier tipo. Al igual que la tinción negativa, sólo nos permite observar la forma, el tamaño y el tipo de agrupación de las células.
Diferencial: Intervienen dos o más colorantes y cada uno diferencia una estructura. El colorante que se usa en segundo lugar es de color diferente al del primero, denominándose colorante de contraste.

Los colorantes se clasifican en:

básicos o catiónicos: si el ión coloreado es positivo (catión).
Estos se combinan con elementos cargados negativamente de la célula, como lo son los ácidos nucleicos (ADN  y  ARN) y los polisacáridos.
Ejemplos: azul de metileno, cristal violeta y safranina.

ácidos o aniónicos: el ion coloreado es negativo (anión)
estos se combinan con elementos cargados positivamente de la célula, como lo son muchas proteínas
Ejemplos: eosina, fucsina ácida y el rojo congo.

Otro grupo de colorantes son sustancias liposolubles; que se combinan con los lípidos celulares revelando la localización de depósitos de grasa
Ejemplo: negro Sudán

Algunos colorantes tiñen mejor solo después de que la célula  haya sido tratada con otra sustancia química, que no es un colorante en si, esta sustancia se denomina, mordiente.
Ejemplo: ácido tánico

               

Tinción de Gram

Es la técnica de tinción diferencial más importante que se utiliza en bacterias. El primero en describirla fue el danés Christian Gram. Consiste básicamente en añadir lo siguiente:

Cristal violeta (colorante azul)
Lugol (mordiente, sustancia no colorante que refuerza la acción de un colorante)
Etanol 96° (decolorante que remueve el colorante de ciertas bacterias)
Safranina (colorante de contraste, rojo)

Esta tinción distingue entre dos amplios grupos de bacterias según la composición de la pared celular; las Gram (-) que no retienen el complejo cristal violeta-lugol después de la decoloración con alcohol y aparecen teñidas de rojo, y las Gram (+) que sí lo retienen y aparecen teñidas de azul oscuro.

Realización:

  1. Preparar frotis bacterianos.
  2. Teñir con cristal violeta (1 minuto).
  3. Lavar con abundante agua el exceso de colorante.
  4. Cubrir con Lugol (1minuto)
  5. Lavar con agua el exceso de Lugol.
  6. Decolorar con alcohol-acetona, hasta que la preparación deje de perder color (30 segundos).
  7. Lavar con abundante agua para eliminar el resto de disolvente.
  8. Teñir con Safranina (1 minuto).
  9. Lavar con agua para eliminar el colorante de contraste.
  10. Secar la preparación.
  11. Examinar al microscopio.

No hay comentarios:

Publicar un comentario