Morfología y formas bacterianas:
las bacterias pueden presentar diversos tamaños y formas,
pero existen tres formas básicas.
esféricas (cocos)
bastoncitos o cilíndricas (bacilos)
helicoidales (espirilos)
Los cocos libres aparecen como células esféricas aisladas. Pero después de
una división celular muchas bacterias no
se separan totalmente, originando distintos agrupamientos.
Estos agrupamientos se denominan:
cocos en pares (diplococos), en cadena (estreptococos),
en tetradas, en racimos (estafilococos), en cubos (sarcina).
Los bacilos si son cortos, se denominan cocobacilos.
Los bacilos bacterianos curvos en forma de coma se denominan
vibrios y los levemente helicoidales en una curvatura, espiroquetas.
La mayor parte de las bacterias tienen una longitud media de
1 a 5 µm, aunque alguna pueden alcanzar de 30 hasta 300 µm.
OBSERVACIÓN DE LOS MICROORGANISMOS
La morfología bacteriana se puede observar de
dos maneras:
1. en estado
vivo
2. muertas o
coloreadas
Las bacterias en estado vivo son en general incoloras y
carentes de contraste con el agua en donde se encuentran en suspensión como
para ser vistas.
Es por esto que se usan colorantes que poseen afinidad por
algún componente celular dando color a las diferentes partes celulares.
Todos los microorganismos,
excepto los virus, pueden ser observados mediante microscopios ópticos, por lo
que nos vamos a limitar a describir las técnicas más comúnmente usadas para
realizar preparaciones para microscopios ópticos.
1.- Preparación en estado vivo (o en fresco):
1.- Preparación en estado vivo (o en fresco):
Para poder observar la movilidad
de un microorganismo es preciso que no esté fijado. Consiste en suspender una
gota, tomada directamente de la muestra, sobre un portaobjetos y cubriéndola,
sin formar burbujas de aire, con un portaobjetos se observa al microscopio de
contraste de fases.
2.- Técnicas de tinción o coloración:
En general, el proceso seguido en todas las tinciones conlleva las siguientes etapas: extensión, fijación, tratamiento con colorantes y observación.
1.- Extensión: se realiza sobre un portaobjetos que ha de estar totalmente limpio. Si la muestra es líquida se hace directamente y, si es sólida, hay que resuspenderla previamente en una gota de H2O.
2.- Fijación: tiene por objeto adherir la muestra al portaobjetos y desnaturalizar las proteínas para facilitar la acción del colorante. Normalmente se realiza con calor, pasando la muestra repetidamente a 10 cm de la llama del mechero.
2.- Técnicas de tinción o coloración:
En general, el proceso seguido en todas las tinciones conlleva las siguientes etapas: extensión, fijación, tratamiento con colorantes y observación.
1.- Extensión: se realiza sobre un portaobjetos que ha de estar totalmente limpio. Si la muestra es líquida se hace directamente y, si es sólida, hay que resuspenderla previamente en una gota de H2O.
2.- Fijación: tiene por objeto adherir la muestra al portaobjetos y desnaturalizar las proteínas para facilitar la acción del colorante. Normalmente se realiza con calor, pasando la muestra repetidamente a 10 cm de la llama del mechero.
La fijación de una extensión
bacteriana es imprescindible para que las bacterias queden
inactivadas y adheridas al
vidrio. De esta manera, no se pierden en los pasos de lavado
necesarios para la tinción. Se
debe procurar, además, que este proceso altere lo menos posible
la morfología bacteriana.
Si las bacterias se encuentran
resuspendidas en agua, la fijación puede hacerse por calentamiento
de la muestra sobre el
portaobjetos. Es sumamente importante no excederse en este proceso para que
las bacterias no se deformen o se
rompan.
La fijación de bacterias que se
hallan en su propio medio de cultivo debe hacerse empleando un
procedimiento alternativo como la
fijación con metanol. La fijación al calor no da en este caso buen resultado,
pues la capa de materia orgánica que contiene las bacterias, una vez realizada
la extensión, tiende a despegarse con facilidad en los lavados posteriores.
REALIZACIÓN
Preparación de un frotis
bacteriano.
1. Colocar una pequeña gota de
agua en un portaobjetos limpio.
2. Con el asa de siembra
previamente flameada transferir una pequeña cantidad del cultivo bacteriano en
medio sólido a la gota. Remover la mezcla hasta formar una suspensión homogénea
y extenderla para facilitar su secado.
Nota: si el material de partida
es un cultivo en medio liquido, no es necesario realizar estos dos primeros
pasos. Basta con colocar y extender una muestra de la suspensión bacteriana
directamente sobre el portaobjetos.
3. Esperar hasta que la fina película
de líquido se evapore o bien acelerar este proceso con un ventilador o un
secador. No eliminar el líquido calentando el portaobjetos a la llama, pues las
células pueden deformarse o romperse.
4. Fijación de las bacterias al
vidrio portaobjetos:
a) Por calor (bacterias
procedentes de medio sólido). Pasar tres veces el portaobjetos por la llama
durante unos segundos. Dejar enfriar el portaobjetos entre los pases.
b) Con metanol (bacterias
procedentes de medio liquido). Añadir unas gotas de metanol sobre la extensión
completamente seca. Retirar de inmediato el exceso de metanol del portaobjetos,
golpeándolo por su canto con cuidado contra la mesa de trabajo. Esperar a que
el metanol se evapore completamente.
Tinción simple:
5. Cubrir los frotis con
abundante colorante, uno de ellos con cristal violeta y el otro con safranina.
Dejar actuar los colorantes durante 2 min.
6. Lavar las preparaciones con
agua para eliminar el exceso de colorante. Para ello, inclinar el portaobjetos
y aplicar el chorro de agua en su parte superior permitiendo que resbale sobre
el frotis. No dirigir el agua directamente sobre el frotis pues podría
arrastrar parte de el consigo.
7. Eliminar la máxima cantidad de
agua de los portaobjetos golpeándolos por su canto con cuidado contra la
superficie de la mesa de trabajo.
8. Esperar hasta que el líquido
se evapore. Este proceso se puede acelerar secando el portaobjetos por simple presión
entre dos papeles de filtro (en ningún caso frotar el portaobjetos).
9. Observar la preparación al
microscopio con el objetivo de inmersión. Seleccionar un buen campo de
observación y dibujarlo ilustrando la morfología y agrupación de las bacterias.
3.- Tinción: se realiza añadiendo los colorantes sobre los
microorganismos sometidos a los procesos anteriores. Puede ser de varios
tipos:
Negativa: Los colorantes no tiñen el microorganismo, sino el entorno, aumentando de este modo su contraste. La muestra se extiende sobre una gota del colorante (nigrosina).
Simple: Se utiliza un solo colorante que puede ser de cualquier tipo. Al igual que la tinción negativa, sólo nos permite observar la forma, el tamaño y el tipo de agrupación de las células.
Diferencial: Intervienen dos o más colorantes y cada uno diferencia una estructura. El colorante que se usa en segundo lugar es de color diferente al del primero, denominándose colorante de contraste.
Negativa: Los colorantes no tiñen el microorganismo, sino el entorno, aumentando de este modo su contraste. La muestra se extiende sobre una gota del colorante (nigrosina).
Simple: Se utiliza un solo colorante que puede ser de cualquier tipo. Al igual que la tinción negativa, sólo nos permite observar la forma, el tamaño y el tipo de agrupación de las células.
Diferencial: Intervienen dos o más colorantes y cada uno diferencia una estructura. El colorante que se usa en segundo lugar es de color diferente al del primero, denominándose colorante de contraste.
Los colorantes se clasifican en:
básicos o catiónicos:
si el ión coloreado es positivo (catión).
Estos se combinan con elementos cargados negativamente de la
célula, como lo son los ácidos nucleicos (ADN
y ARN) y los polisacáridos.
Ejemplos: azul de metileno, cristal violeta y safranina.
ácidos o aniónicos:
el ion coloreado es negativo (anión)
estos se combinan con elementos cargados positivamente de la
célula, como lo son muchas proteínas
Ejemplos: eosina, fucsina ácida y el rojo congo.
Otro grupo de colorantes son sustancias liposolubles;
que se combinan con los lípidos celulares revelando la localización de
depósitos de grasa
Ejemplo: negro Sudán
Algunos colorantes tiñen mejor solo después de que la célula
haya sido tratada con otra sustancia
química, que no es un colorante en si, esta sustancia se denomina, mordiente.
Ejemplo: ácido tánico
Tinción de Gram
Es la técnica de tinción diferencial más importante que se utiliza en bacterias. El primero en describirla fue el danés Christian Gram. Consiste básicamente en añadir lo siguiente:
Cristal violeta (colorante azul)
Lugol (mordiente, sustancia no colorante que refuerza la acción de un colorante)
Etanol 96° (decolorante que remueve el colorante de ciertas bacterias)
Safranina (colorante de contraste, rojo)
Esta tinción distingue entre dos amplios grupos de bacterias según la composición de la pared celular; las Gram (-) que no retienen el complejo cristal violeta-lugol después de la decoloración con alcohol y aparecen teñidas de rojo, y las Gram (+) que sí lo retienen y aparecen teñidas de azul oscuro.
Realización:
- Preparar frotis bacterianos.
- Teñir con cristal violeta (1 minuto).
- Lavar con abundante agua el exceso de colorante.
- Cubrir con Lugol (1minuto)
- Lavar con agua el exceso de Lugol.
- Decolorar con alcohol-acetona, hasta que la
preparación deje de perder color (30 segundos).
- Lavar con abundante agua para eliminar el resto
de disolvente.
- Teñir con Safranina (1 minuto).
- Lavar con agua para eliminar el colorante de
contraste.
- Secar la preparación.
- Examinar al microscopio.
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