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viernes, 26 de diciembre de 2014

AGUA CALIDAD FARMACÉUTICA / ALIMENTICIA : MUESTREO Y ANÁLISIS


El análisis de las muestras de aguas, es muy importante, sobre todo en aquellas empresas que disponen de una planta de tratamiento, y recirculación del agua,  que sería lo correcto. El resultado de dichos análisis debe reflejar el buen funcionamiento de la purificación del agua, y demás tratamientos.
Dependiendo del uso que se le dará al agua, se clasifica, según USP y disposiciones del ANMAT en:
Agua corriente (de red)
Agua purificada
Agua destilada

MUESTREO

El muestreo debe realizarse según el procedimiento vigente de la empresa.

Es muy importante realizar el muestreo de manera  aséptica ya que de lo contrario, el análisis posterior de la muestra es invalidado.
El objetivo principal es no contaminar la muestra, por lo que  se deben tomar ciertas precauciones:
La muestra debe mantenerse refrigerada hasta el momento del análisis, para evitar la proliferación de los microorganismos.
En el caso de una salida de agua común, se debe sanitizar con alcohol 70º, o con solución de hipoclorito de sodio.
Luego purgar, de ser posible, en un balde, aproximadamente, 20 litros.
En el caso de que la salida de agua sea difícil de alcanzar, puede utilizarse una manguera estéril.
De la misma forma, si la salida de agua se utiliza con una manguera, debe muestrearse a la salida de la misma. No deberá retirarse, ya que la muestra de agua debe ser representativa del agua de uso cotidiano.
Los envases a utilizar deben estar estériles.
El analista que toma la muestra deberá usar guantes estériles, y de ser necesario, paños estériles.
Para aguas potables, utilizar algún neutralizante del cloro, como tiosulfato de sodio, por ejemplo.



AGUAS DE RED O CORRIENTE

ASPECTO
Liquido incoloro, transparente, inodoro.
Libre de partículas extrañas.

TECNICA MICROBIOLOGICA
CONTROL HIGIENICO DE AGUAS
MATERIALES NECESARIOS

v      recipiente estéril de 500 ml de capacidad, aproximadamente
v      portafiltros para filtración, estériles
v      embudos y filtros de vidrio o plástico estériles
v      membranas estériles de nitrato de celulosa (NC), de no más de 45 µm de poro, de 47 mm de diámetro
v      pipetas de 10ml y de 1 ml, estériles
v      ansas estériles descartables, o de metal
v      tubos de ensayo estériles con 10 ml de caldo Mc Conkey de doble concentración, y campanita de Durham invertida
v      tubos de ensayo estériles con 10 ml de caldo Mc Conkey de simple concentración, y campanita de Durham invertida
v      placas de petri estériles con 15-20 ml de TSA
v      placas de petri estériles con 15-20 ml de Cetrimide
v      placas de petri estériles con 15-20 ml de EMB-Levine
v      placas de petri estériles con 15-20 ml de agar P
v      placas de petri estériles con 15-20 ml de agar F
v      placas de petri estériles con 15-20 ml de agar Fluorocult
v      tubo/frasco Schott con tapa estéril con 100 ml de Caldo Lactosado
v      tubo/frasco Schott con tapa estéril con 100 ml de Caldo TSB (optativo, ya que puede reemplazarse por el Caldo Lactosado)
v      Frascos con tapa estériles con 400 ml de solución de Tiosulfato de sodio 0.5%
v      Frascos con tapa con solución de lavado tipo Peptona, o PLP, o similar, estériles
v      Pinzas estériles
v      Balde para purga de puntos

PROCEDIMIENTO

RECUENTO DE MICROORGANISMOS AEROBIOS TOTALES

Ø      Preparar el dispositivo filtrante con una membrana estéril de no más de 45 µm de poro, de NC de 47 mm de diámetro
Ø      Filtrar 10 ml de la muestra
Ø      Enjuagar la membrana con 3 porciones de 100 ml c/u, de solución de Tiosulfato de sodio, 0.5%
Ø      Retirar la membrana con una pinza estéril, y colocarla en una placa de TSA, con la precaución de colocar el lado donde se recogieron las bacterias durante el filtrado, hacia arriba. Además, no deben quedar burbujas entre la membrana y el agar
Ø      Repetir el procedimiento, pero filtrando una solución formada por 1 ml de muestra suspendido en 30 ml de solución de lavado
Ø      Incubar las placas sin invertir en estufa de 30-35 ºC +/- 2 ºC, durante 48 hs
Ø      Luego de la incubación, contar la cantidad de colonias obtenidas, que se desarrollaron en la superficie de la membrana
Ø      Si ambas placas tienen un recuento muy alto, y no puede realizarse fácilmente, repetir utilizando diluciones sucesivas de la muestra
Ø      Informar UFC/ml


INVESTIGACION DE Pseudomonas aeruginosa y Escherichia coli

Ø      Luego de realizar la filtración para el recuento, colocar una membrana nueva en el dispositivo filtrante
Ø      Filtrar 200 ml de muestra
Ø      Lavar con 3 porciones de 100 ml cada una, de solución de Tiosulfato de sodio, 0.5%
Ø      Colocar la membrana en el Caldo Lactosado
Ø      Repetir, y colocar en el frasco con Caldo TSB
Ø      Incubar preferentemente a 35ºC +/- 2ºC (sino, puede usarse la misma estufa que para aerobios totales)

INVESTIGACION DE Pseudomonas aeruginosa

Ø      Luego de 48 hs de incubación, si no se observa turbidez por desarrollo en el Caldo Lactosado, informar Ausencia de Pseudomonas aeruginosa
Ø      Si se observa turbidez en el Caldo Lactosado, repicar con ansa descartable estéril o ansa metálica esterilizada a la llama, sobre placa de agar Cetrimide.
Ø      Incubar invertida preferentemente a 35ºC +/- 2ºC (sino, puede usarse la misma estufa que para aerobios totales)
Ø      Luego de 48 hs de incubación, realizar la lectura de la placa: si no se observa desarrollo, Informar Ausencia de Pseudomonas aeruginosa
Ø      Si se observa desarrollo típico (colonias amarillo verdoso, con fluorescencia a la luz UV a 366 nm formadoras de pigmento verde azulado), continuar la marcha de identificación para Pseudomonas aeruginosa, mediante los siguientes ensayos:
o        Test de Oxidasa: colocar sobre las colonias sospechosas, tiras o discos de papel embebidos en solución de N,N-dimetil-p-fenildiamina al 1% en agua destilada. Las colonias positivas para este ensayo originan un color rosado que progresivamente se  transforma en púrpura oscura. Pseudomonas aeruginosa es OXIDASA POSITIVO
o        Formación de piocianina: repicar algunas de las colonias sospechosas sobre una placa de agar P, e incubar invertida preferentemente a 35ºC +/- 2ºC, durante 48-72 hs. Las colonias características que desarrolla la Pseudomonas aeruginosa en este agar, son amarillo-verdosas, con zonas de pigmentación azul difundida en el agar, correspondiente a la piocianina.
o        Formación de Fluoresceína: repicar algunas de las colonias sospechosas sobre una placa de agar F, e incubar invertida preferentemente a 35ºC +/- 2ºC, durante 48-72 hs. Las colonias características que desarrolla la Pseudomonas aeruginosa en este agar, son amarillentas con zonas de pigmentación amarilla y fluorescencia amarilla a verdosa a la luz UV (366 nm), correspondiente a la fluoresceína.
Ø      Si los 3 ensayos dan POSITIVOS, la probabilidad de que sea Pseudomonas aeruginosa es muy alta. Confirmar la identificación con API, o prueba similar

INVESTIGACION DE Escherichia coli

Ø      Luego de 48 hs de incubación, si no se observa turbidez por desarrollo en el Caldo Lactosado, informar Ausencia de Escherichia coli
(Si se utilizo el caldo TSB, la investigación se realiza basándose en este caldo)
Ø      Si se observa turbidez en el Caldo Lactosado (o Caldo TSB si corresponde), repicar con ansa descartable estéril o ansa metálica esterilizada a la llama, sobre placa de agar  EMB-Levine
Ø      Incubar invertida preferentemente a 35ºC +/- 2ºC (sino, puede usarse la misma estufa que para aerobios totales)
Ø      Luego de 48 hs de incubación, realizar la lectura de la placa: si no se observa desarrollo, Informar Ausencia de Escherichia coli
Ø      Si se observa desarrollo típico (colonias de 2-3 mm de diámetro, con brillo metálico verdoso a la luz reflejada y centro oscuro hasta negro con luz transmitida), continuar la marcha de identificación para Escherichia coli mediante el siguiente ensayo:
o        Agar Fluorocult: repicar algunas de  las colonias sospechosas, en agar Fluorocult. Incubar invertida preferentemente a 35ºC +/- 2ºC (sino, puede usarse la misma estufa que para aerobios totales). Si se observan colonias con fluorescencia al UV (366 nm), la probabilidad de que sea Escherichia coli es muy alta. Confirmar la identificación con API, o prueba similar

RECUENTO DE COLIFORMES POR NUMERO MAS PROBABLE (NMP)

Ø      Agregar 10 ml de muestra a 3 tubos de caldo MC Conkey doble concentración
Ø      Agregar 1 ml de muestra a 3 tubos de caldo MC Conkey  simple concentración
Ø      Agregar 0.1 ml de muestra a 3 tubos de caldo MC Conkey  simple concentración
Ø      Incubar los 9 tubos a 35ºC +/- 2ºC, junto con un tubo de cada concentración, sin muestra, como control negativo
Ø      Luego de la incubación, contar los tubos con producción de acido (visualizado por el viraje  de color violeta amarillo), y la formación de gas (visualizado por la formación de burbujas dentro de la campanita de Durham), y de acuerdo a la cantidad sembrada, comparar con la tabla de NMP, para determinar como resultado el número más probable en 100 ml de muestra (NMP/100 ml)


TABLA DE NMP/ml

NUMERO DE TUBOS POSITIVOS
MNP/100ml
LIMITE DE CONFIANZA (95%)
3 TUBOS (10 ml)
3 TUBOS (1 ml)
3 TUBOS (0,1 ml)
INFERIOR
SUPERIOR
0
0
1
3
0,5
9
0
1
0
3
0,5
13
1
0
0
4
0,5
20
1
0
1
7
1
21
1
1
0
7
1
23
3 TUBOS (10 ml)
3 TUBOS (1 ml)
3 TUBOS (0,1 ml)

INFERIOR
SUPERIOR
1
1
1
11
3
36
1
2
0
11
3
36
2
0
0
9
1
36
2
0
1
14
3
37
2
1
0
15
3
44
2
1
1
20
7
89
2
2
0
21
4
47
2
2
1
28
10
150
2
0
0
23
4
120
3
0
1
39
7
130
3
0
2
64
15
380
3
1
0
43
7
210
3
1
1
75
14
230
3
1
2
120
30
380
3
2
0
93
15
380
3
2
1
150
30
440
3
2
2
210
35
470
3
3
0
240
36
1300
3
3
1
460
71
2400
3
3
2
1100
150
4800

ESPECIFICACIONES MICROBIOLOGICAS

NIVEL DE ACCION

Recuento de aerobios totales: 100 UFC/ml
Recuento de coniformes totales: >3 UFC/100ml
Ausencia de patógenos:
Pseudomonas aeruginosa: presencia/200 ml
Escherichia coli: presencia/200 ml

AGUA PURIFICADA

ASPECTO
Liquido incoloro, transparente, inodoro.
Libre de partículas extrañas.

TECNICA MICROBIOLOGICA
CONTROL HIGIENICO DE AGUAS

MATERIALES NECESARIOS:
IDEM AGUA DE RED

PROCEDIMIENTO

RECUENTO DE MICROORGANISMOS AEROBIOS TOTALES

Ø      Preparar el dispositivo filtrante con una membrana estéril de no más de 45 µm de poro, de NC de 47 mm de diámetro
Ø      Filtrar 10 ml de la muestra
Ø      Enjuagar la membrana con 3 porciones de 100 ml c/u, de peptona, PLP o solución de lavado similar
Ø      Retirar la membrana con una pinza estéril, y colocarla en una placa de TSA, con la precaución de colocar el lado donde se recogieron las bacterias durante el filtrado, hacia arriba. Además, no deben quedar burbujas entre la membrana y el agar
Ø      Repetir el procedimiento, pero filtrando una solución formada por 1 ml de muestra suspendido en 30 ml de solución de lavado
Ø      Incubar las placas sin invertir en estufa de 30-35 ºC +/- 2 ºC, durante 48 hs
Ø      Luego de la incubación, contar la cantidad de colonias obtenidas, que se desarrollaron en la superficie de la membrana
Ø      Informar UFC/ml

INVESTIGACION DE Pseudomonas aeruginosa y Escherichia coli

IDEM AGUA DE RED

INVESTIFACION DE Pseudomonas aeruginosa

IDEM AGUA DE RED

INVESTIFACION DE Escherichia coli

IDEM AGUA DE RED

ESPECIFICACIONES MICROBIOLOGICAS

NIVEL DE ALERTA

Recuento de aerobios totales: 10 UFC/ml

NIVEL DE ACCION

Recuento de aerobios totales: 100 UFC/ml
Ausencia de patógenos:
Pseudomonas aeruginosa: presencia/200 ml
Escherichia coli: presencia/200 ml

AGUA DESTILADA

ASPECTO
Liquido incoloro, transparente, inodoro.
Libre de partículas extrañas.

TECNICA MICROBIOLOGICA
CONTROL HIGIENICO DE AGUAS

MATERIALES NECESARIOS:

IDEM AGUA DE RED

PROCEDIMIENTO

RECUENTO DE MICROORGANISMOS AEROBIOS TOTALES

Ø      Preparar el dispositivo filtrante con una membrana estéril de no más de 45 µm de poro, de NC de 47 mm de diámetro
Ø      Filtrar 100 ml de la muestra
Ø      Enjuagar la membrana con 3 porciones de 100 ml c/u, de peptona, PLP, o polución de lavado similar
Ø      Retirar la membrana con una pinza estéril, y colocarla en una placa de TSA, con la precaución de colocar el lado donde se recogieron las bacterias durante el filtrado, hacia arriba. Además, no deben quedar burbujas entre la membrana y el agar.
Ø      Incubar la placa sin invertir en estufa de 30-35 ºC +/- 2 ºC, durante 48 hs
Ø      Luego de la incubación, contar la cantidad de colonias obtenidas, que se desarrollaron en la superficie de la membrana.
Ø      Informar UFC/100 ml



INVESTIGACION DE Pseudomonas aeruginosa y Escherichia coli

IDEM AGUA DE RED

INVESTIFACION DE Pseudomonas aeruginosa

IDEM AGUA DE RED

INVESTIFACION DE Escherichia coli

IDEM AGUA DE RED

ESPECIFICACIONES MICROBIOLOGICAS

NIVEL DE ALERTA

Recuento de aerobios totales: 3 UFC/100 ml

NIVEL DE ACCION

Recuento de aerobios totales: 10 UFC/100 ml
Ausencia de patógenos:
Pseudomonas aeruginosa: presencia/200 ml
Escherichia coli: presencia/200 ml


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