PIRETOGENOS Y ENDOTOXINAS
Características generales:
El ensayo de piretógenos se realiza
sobre los productos inyectables, que es un requerimiento esencial para la
protección del paciente.
La actividad mas conocida de las
sustancias piretógenas es su capacidad de producir fiebre, pero también
producen alteración del cuadro hemático, del metabolismo de los hidratos de
carbono, de la función renal, etc.
Existen muchas sustancias con
actividad piretógena, aunque los mas conocidos son las endotoxinas. Estas son
lipopolisacaridos que se encuentran en la pared celular de las bacterias Gram
negativas, estas moléculas ejercen su efecto piretógeno solo cuando son
liberadas mediante lisis celular.
Una de las características mas
importantes es que las endotoxinas son muy resistentes al calor. Soportan
temperaturas mayores a 60 °C durante horas sin perder la toxicidad.
Un producto estéril no significa que este libre de endotoxinas, ya que debido a su alta resistencia a la destrucción química y térmica, sobrevive a los métodos comunes de esterilización.
Fuentes de contaminación:
Las vías por las cuales se puede
contaminar un producto con endotoxinas son:
*Diluyentes: el agua que se usa para
inyectables debe ser purificada y cumplir con el ensayo de piretógenos.
*Principios activos y excipientes:
*Productos obtenidos por
fermentación bacteriana; hormonas y enzimas aisladas de orina humana (como
gonadotrofina, urokinasa) y todo otro material de origen natural o sintético
que pueda dar lugar al desarrollo e invasión microbiana.
*El vidrio puede absorber
piretógenos ya sea por el agua u otros materiales piretógenos. Es posible que
estas sustancias sean cedidas a la solución al autoclavar el lote.
*Mala practica en la manufactura.
Por lo tanto se realiza el ensayo de
piretógenos a los productos inyectables, materias primas que estén codificadas,
al agua purificada, etc.
Métodos de despirogenado:
Los métodos mas comunes de
despirogenado son:
1-Calor seco: El despirogenado por
calor seco es la opción para la mayoría de los productos resistentes al calor
como es el vidrio, equipos de metal, etc. El tiempo y temperatura de exposición
es 250°C durante 30 min, o 180 °C durante 3 horas.
2-Hidrólisis ácida: Se utiliza una
solución de HCl 0.05N durante 30 min a 100 °C.
3-Hidrólisis alcalina: La alteración
de la actividad piretógena resulta de la saponificación de los ácidos grasos
del lipopolisacarido. Se utiliza NaOH 0.1 N en etanol 95%, pero esta hidrólisis
no asegura la inactivación total de las endotoxinas.
4-Oxidación: Se utiliza peroxido de
hidrógeno que acciona sobre el lipopolisacarido.
5-Acilacion: El tratamiento de la
endotoxina con ácido acético disminuye la pirogenicidad en un factor de 100.
6-Alquilacion: Se utiliza oxido de
etileno.
Remoción de endotoxinas:
1-Lavado o dilución: Es el método
mas simple para remover piretógenos.
Se enjuaga el equipo o material con
solución apirógena (agua para inyectable) que remueve la endotoxina superficial
o la diluye a concentraciones no piretógenas.
2-Destilación: Es el método mas
antiguo para remover piretógenos en agua.
3-Ultrafiltración: Se utiliza para
remover piretógenos en drogas de peso molecular bajo o mediano.
4-Osmosis reversa: Las membranas de
osmosis inversa remueven las endotoxinas por exclusión de tamaño.
5-Carbón activado:
6-Atracción hidrofóbica:
Ensayos:
El ensayo de piretógenos mide el
aumento de la temperatura corporal en conejos a los cuales se le administra la
solución por vía endovenosa. Este ensayo es una prueba empírica cuyos
resultados dependen enteramente de la sensibilidad del conejo al piretogeno
administrado.
Otras desventajas de este método
son:
*Las bacterias gram negativas
(fuente de endotoxinas) son parte de la flora natural del conejo, por lo tanto
pueden desarrollar diferentes grados de inmunidad rente a estas moléculas.
*La respuesta farmacológica en
conejos puede ser inconstante debido al estrés, por lo cual los resultados no
son confiables ni reproducibles.
*Al ser una valoración biológica
debe ser validada utilizando un patron de la misma naturaleza del desconocido,
esto no se cumple.
La prueba de endotoxinas bacterianas
(test de LAL o gel en tubo) es un ensayo in vitro, no requiere animales de
laboratorio, pero si condiciones específicas. En la actualidad exigen el
control de piretógenos por el metodo de lisado de amebocitos de Limulus (LAL).
Se demostró que para una endotoxina
purificada el test de endotoxinas es de 5 a 10 veces mas sensible que el ensayo
en conejos. Además el ensayo de endotoxinas es muy útil en ciertos inyectables
específicos en los que el ensayo en conejos es impracticables como por ejemplo
fármacos radioactivos, ciertos citostaticos, anestésicos, productos con
actividad antigénica, etc.
En tanto que el ensayo de
piretógenos en conejos detectan cualquier sustancia pirogenica, el ensayo LAL
solo detecta endotoxinas.
Reactivo LAL:
El lisado de amebocitos de Limulus
es un extracto acuosos de las células sanguíneas (amebocitos) del cangrejo de
herradura, el Limulus polyphemus. En
presencia de endotoxinas, ciertos factores en el LAL se activan en una
cascada proteolítica que según como se lee el resultado es el método utilizado
para su detección. Existen 3 variaciones
*Método de gelificacion o gel clot:
El método de gel clot es el ensayo clásico, el mas sencillo y menos costoso. La
presencia de endotoxinas es determinada por la formación de un gel o coagulo
insoluble. Se puede desarrollar de forma cuantitativa o cualitativa.
*Métodos turbidimetricos: Estos
métodos se fundamentan por el aumento de la turbidez en la mezcla de reacción
provocado por el incremento de la concentración de coagulina insoluble, el cual
se monitorea espectrofotometricamente. La proporción de turbidez esta
relacionada con la concentración de endotoxinas en la muestra.
*Métodos cromogenicos: Se
fundamentan en el empleo de un sustrato cromogenico sintético incoloro. La
proporción de la coloracion esta relacionada con la concentración de
endotoxinas en la muestra.
Definiciones:
Limite de endotoxinas (LE): Es la cantidad máxima de endotoxinas admitida
para un producto en particular. Generalmente se encuentra en las monografías.
Máxima dilución valida(MDV): Es el
factor máximo de dilución para la muestra y corresponde a la máxima dilución en
el cual el limite de endotoxina puede ser determinado en las condiciones del
ensayo.
Cuando el LE se especifica en UE/ml
se divide por la sensibilidad declarada por el proveedor.
Cuando el LE se especifica en UE/mg
o UE/UI se multiplica por la concentración de la droga a validar y se divide
por la sensibilidad declarada por el
proveedor.
MDV= Limite de endotoxina x
Concentración del producto
Sensibilidad del
reactivo (λ)
Dilución de trabajo (WD): Es la
dilución utilizada para realizar el ensayo. Es la menor dilución de la muestra
que presenta un resultado negativo para la muestra y positivo para el control.
