Google+ Followers

sábado, 30 de noviembre de 2013

FERMENTACIÓN : ESTEQUEOMETRIA Y CINÉTICA DE CRECIMIENTO


Aspectos fundamentales de la Fermentación

 Estequeométrico:

ÞLa concentración final de células (Biomasa) y productos de fermentación depende de la concentración y composición del medio de cultivo y del balance de materia y energía de los procesos de crecimiento celular

Cinético:
Þ velocidad en la que se desarrolla el proceso


 En la estequeometría de producción de masa celular (biomasa) consideramos al crecimiento de un organismo como una reacción química. Por lo tanto se pueden formular ecuaciones y realizar el balance de esa ecuaciones. 


Fuente de C + Fuente de N + O2 + minerales + nutrientes específicos   ------------>  Masa celular (Biomasa) + Productos + CO2 + H2O + Calor





Los productos son resultado del metabolismo primario y/o secundario


Formación de productos

  1. Asociado al crecimiento 
  2. Semiasociado al crecimiento 
  3. No asociado al crecimiento 





      
                                                                                              Tiempo               Tiempo           Tiempo

Un medio de cultivo necesita tener fuente de carbono y energía (sustrato), fuente de nitrógeno, Macroelementos,  Microelementos y oxigeno. La ecuación da como resultado biomasa, productos del metabolismo primario/secundario, dióxido de carbono, agua y calor


Composición de los medios de cultivo












CALCULO ESTEQUIOMETRICO




Para realizar el cálculo estequeométrico es necesario conocer la composición elemental de un microorganismo, sino se conoce puede tomarse la fórmula promedio que  es igual a:
C H 1.79 O 0.5 N 0.2 ,    (representa el 95% p/p de la biomasa)
de tal modo es posible calcular cuanto pesa un carbono mol de biomasa:
1 C-mol de biomasa es igual

12 + 1.79+ 16*0.5 + 14*0.2   = 25.8 g
                  0.95
De forma análoga se puede definir: 

1 C-mol de fuente de carbono y energía: cantidad de fuente de carbono y energía  que contiene 1 átomo gramo de carbono.
1 C-mol de producto:cantidad de producto que contiene 1 átomo gramo de carbono.
Ambos se pueden calcular según:





























La aplicación de la estequeometría requiere conocer los rendimientos, que se definen como el cociente entre el producto obtenido y el sustrato consumido.

Balance de materia














El coeficiente de respiración RQ, moles de CO2 producidos por moles de O2 consumidos, permite resolver estas 4 ecuaciones con 5 incógnitas y hallar el valor de los coeficientes a, b, c, d, e : 







Valores de RQ 
S. cerevisieae = 1,033 (glucosa)
S cerevisieae = 0,43 (hexadecano)


Yx/s = c-moles de biomasa formada
Por cada c-mol de fuente de
C y E

Donde s x y s s es la fracción de carbono en la biomasa y en el sustrato
respectivamente. s x suele ser una constante para de valor de 0.465


Ejemplo: Determinación de los coeficientes estequiométricos para el crecimiento aerobio de Saccharomyces cerevisieae sobre glucosa


BALANCES



CRECIMIENTO MICROBIANO

Definiciones: 

El
crecimiento individual procariota continúa hasta que se divide en nuevas células, es decir la fisión binaria. Durante el ciclo, todos los constituyentes celulares se incrementan en número y la célula hija recibe un cromosoma completo y copias de moléculas, monómeros e iones.
El crecimiento poblacional es el aumento en el número de células de una población, lo que puede medirse como aumento de la masa microbiana.
La velocidad de crecimiento es el cambio en el número de células o masa celular por unidad de tiempo.
El tiempo de generación es el tiempo requerido para que a partir de una célula se formen dos células.

Crecimiento exponencial

El modelo de incremento de la población en el que el número de células se dobla cada cierto período de tiempo se conoce como Crecimiento Exponencial.
Cuando esto se representa en ejes de escala aritmética, se obtiene una curva característica en la cual se va incrementando progresivamente la pendiente. Una característica que me indica que el crecimiento es exponencial es que la velocidad de incremento en el número de células es lenta inicialmente, para después incrementar constantemente en una explosión.
Para obtener mejor información se utiliza una escala logarítmica (en base 10) para el número de células. Esta función es una recta, que además puede usarse como evidencia que el crecimiento microbiano es exponencial.

Ciclo de crecimiento de poblaciones
En un recipiente cerrado conocido como cultivo en “batch” (cultivo discontínuo), donde el medio no se renueva, ocurre una típica curva de crecimiento, la cual detallaremos a continuación:


  1. Fase de Latencia:
Cuando una población microbiana se inocula en medio fresco, no ocurre crecimiento inmediatamente, sino después de un cierto tiempo que se llama Fase de Latencia, cuya duración depende de varios factores. Si un cultivo en crecimiento exponencial se inocula exactamente en el mismo medio, no se observa esta fase. Sin embargo si el inóculo se toma a partir de un cultivo viejo, entonces tiene lugar una fase de adaptación, incluso si todas las células presentes en el inóculo son viables. Esto ocurre porque las células, en estas condiciones, carecen de determinados componentes esenciales y tiene que transcurrir un cierto tiempo para que se proceda a su síntesis.
También se requiere una fase de latencia cuando las células han sido dañadas o cuando se transfieren de un medio rico a un medio pobre.
  1. Fase exponencial:
Es la consecuencia de que una célula se divida en dos, estas en otras dos, y así sucesivamente. La velocidad es influenciable por las condiciones ambientales y las características genéticas.
  1. Fase estacionaria:
En un cultivo donde no se renueva el medio, el crecimiento exponencial no puede ocurrir indefinidamente lo que habitualmente sucede es que, o bien un nutriente esencial del medio de cultivo se acaba, o algún producto de desecho se acumula en el medio hasta alcanzar concentraciones inhibitorias del crecimiento exponencial.
En esta fase no hay incremento neto del número de células, sin embargo, aunque en esta fase no tiene lugar el crecimiento, todavía ocurren muchas funciones celulares, incluyendo el metabolismo energético.
Algunos microorganismos pueden tener un crecimiento lento, es decir algunas células crecen y otras mueren, siendo el balance total ausencia de incremento en el número de células. Este fenómeno se conoce como Crecimiento Críptico.
  1. Fase de muerte:
Si la incubación continúa después que la población alcanzó la fase estacionaria, las células deben permanecer vivas y metabólicamente activas, pero también deben morir. En algunos casos la muerte va acompañada de lisis celular, sin embargo en muchos casos, la velocidad de muerte es mucho menor que la de crecimiento.



Medición del crecimiento:
Existen diversos métodos para contar el número de células.
-          Contaje total de células:
Se mide directamente al microscopio, en una cámara de New Bauer. Es una manera rápida de estimar el número de células. Tiene limitaciones:
1)       Las células muertas no se distinguen de las vivas.
2)       Las células pequeñas son difíciles de ver.
3)       Se requiere tiempo y habilidad.
4)       Es poco preciso con suspensiones de concentraciones menores a 106 células /ml.

-          Recuento de viables:
Una célula viable se define como la que es capaz de dividirse para dar lugar a descendencia.
Hay dos maneras de llevar a cabo un recuento en placa:
1)       Por siembra en superficie.
2)       Por siembra en profundidad (o vertido en placa)

En el método de siembra en superficie, un volumen no mayor de 0.1 ml de la dilución apropiada se extiende por toda la superficie del medio utilizando una barra de vidrio doblada estéril (espátula de Drigalsky). Es importante que la superficie del medio esté bien seca de modo que el líquido sea absorbido rápidamente.

En el método de siembra en profundidad, se pipetea un volumen conocido (0.1 a 1.0 ml ) de la dilución y se coloca en la placa. Luego se coloca el medio de cultivo fundido previamente y termostatizado a 40-45 ºC, se mezcla y se deja solidificar. El microorganismo que vaya a ser contado debe resistir la temperatura del medio.

  

-          Medidas de masa y turbidez:
Se puede medir la masa celular neta por centrifugación de un volumen conocido y simplemente pesar el precipitado. El procedimiento habitual es determinar el peso seco después de secar las muestras durante 12 horas a 90-110 ºC. la masa seca de las células bacterianas es aproximadamente entre el 10 y 20 % de la masa húmeda.
Un método más útil es la medición de turbidez. Una suspensión celular aparece turbia porque las células dispersan la luz que atraviesa la suspensión. Cuantas más células haya, más luz se dispersa y más turbia aparece la suspensión. La turbidez puede medirse con un fotómetro o espectrofotómetro.
Para organismos unicelulares, las medidas de unidades fotométricas (DO), son proporcionales, dentro e ciertos límites, al número de células. Por lo tanto las medidas de turbidez pueden utilizarse como un sustituto para otros métodos de conteo.

Cultivo continuo :
Un cultivo continuo es esencialmente un cultivo de volumen constante, al que se le añade medio fresco y del que rebosa medio usado con células.
El tipo más común de cultivo continuo es el llamado Quimiostato, que permite el control de la densidad de la población y la velocidad de crecimiento del cultivo. Se usan dos elementos en el control del quimiostato: la velocidad de dilución y la concentración de un nutriente limitante, tal como la fuente de carbono o de nitrógeno.
En el quimiostato la densidad poblacional se controla por la concentración del nutriente limitante presente en el reservorio, y la velocidad de crecimiento se controla por la velocidad de salida.

                                            
  
Efectos de factores ambientales sobre el crecimiento

v      Temperatura:
Para cada microorganismo hay una temperatura mínima por debajo de la cual no existe el crecimiento, una temperatura óptima en donde el crecimiento es el más rápido posible (está más cercana de la máxima que de la mínima) y una temperatura máxima por encima de la cual no existe crecimiento.
Los microorganismos se clasifican según su temperatura óptima de crecimiento en:
-          Psicrófilos: crecen a temperaturas bajas. Rango entre 10 hasta -20 ºC, con una temperatura óptima de 15ºC.
-          Mesófilos: crecen a temperaturas ambientes. Rango entre 10 y 45ºC, con una temperatura óptima de 20 – 40 ºC.
-          Termófilos: crecen a temperaturas altas. Rango entre 25 y 80 ºC, con una temperatura óptima de 50 – 60 ºC.
-          Termófilos extremos: crecen a temperaturas muy altas. Rango entre 80 y 110 ºC.

Temperaturas bajas
Existen también microorganismos psicrotoletantes que son los crecen a 0 ºC, pero su temperatura óptima de crecimiento es de 20 – 40 ºC. Éstos tienen enzimas que funcionan igual aún a bajas temperaturas, y su membrana posee una mayor cantidad de ácidos grasos insaturados que permiten que siga siendo una estructura semifluida a pesar de la temperatura. Durante la congelación de las células, conviene agregar líquidos solubles en agua como el glicerol y el dimetilsulfóxido al 10 %, los cuales protegen a la célula previniendo la formación de cristales dentro de ella.

Temperaturas altas
Algunos microorganismos tienen enzimas estables al calor, las cuales son proteínas estables debido a cambios que tienen en algunos de sus aminoácidos, y además tienen otro plegamiento.
Los microorganismos hipertermófilos tienen además una formación de puente de sal y un empaquetamiento altamente hidrofóbito.

v      pH
Según su tolerancia a los distintos pH, los microorganismos se clasifican en:
-          Acidófilos: crecen a pH externos bajos, entre 1 y 5, mientras que su pH interno es de 6.5. los hongos tienden a ser más tolerantes.
-          Neutrófilos: crecen a pH externos cercanos a la neutralidad, entre 5.5 y 8.5, mientras que su pH interno es de 7.5. En este grupo entran la mayoría de los microorganismos.
-          Alcalófilos: crecen a pH externos altos, entre 9 y 10, mientras que su pH interno es de 9.5. La mayoría son del género Bacillus.

v      Disponibilidad de agua
El agua disponible se mide en términos físicos:  aw (Actividad de agua): p/po (relación entre la presión de vapor de la solución con respecto a la del agua pura).
Nos indica la cantidad de moléculas de agua que están disponibles para ser utilizadas por el microorganismos (o sea que no están ligadas a algún soluto que las esté reteniendo).
Cuando el microorganismo se encuentra en un medio donde el balance de agua es positivo, el agua entra a la célula. Por otro lado, cuando el microorganismo se encuentra en un medio o solución con baja actividad de agua (por ej. una solución de sal ó de azúcar), la célula pierde agua y se produce plasmólisis (la célula se lisa).

Los microorganismos se clasifican en:
-          Halófilos: microorganismos que viven en altas concentraciones de sales, tienen grandes requerimientos de Cloruro de Sodio.
-          Osmófilos: microorganismos que viven en altas concentraciones de azúcares.
-          Xerófilos: microorganismos que viven en ambientes muy secos.

v      Potencial de Oxido – Reducción:

Es una medida de la tendencia que posee el medio de donar ó ceder electrones. Es crítico para el crecimiento y está asociado con el Oxígeno (O2) disuelto que es muy oxidante para las células.
Según los requerimientos de Oxígeno, los microorganismos se clasifican en:

- Aerobios:
  • Estrictos: Necesitan del O2 para crecer, en niveles atmosféricos (21%). Hacen respiración aeróbica.
  • Microaerófilos: Requieren de oxígeno para crecer, pero a niveles más bajos que los atmosféricos (1 - 15 %), debido a que tienen limitada capacidad de hacer respiración aeróbica ó sus enzimas son sensibles al oxígeno.

- Anaerobios:
  • Estrictos: mueren en presencia de oxígeno porque no tienen enzimas que degraden los metabolitos del oxígeno. Realizan respiración anaerobia y fermentación.
  • Facultativos: pueden crecer con presencia o ausencia de oxígeno. Si hay oxígeno realizan respiración aerobia ya que es más energética, sino hacen fermentación y respiración anaeróbica.
  • Aerotolerantes: Crecen en presencia de oxígeno pero no lo utilizan. Realizan fermentación y respiración anaeróbica.

Cuando los cultivos microbianos son:
-          Aerobios estrictos: como el oxígeno es poco soluble en agua y es consumido por los microorganismos, estos cultivos crecen mejor en agitación, tanto sea con aireación forzada o insuflando aire.
-          Microaerófilos : se usa algún método para disminuir la presión de oxígeno.
-          Anaerobios: su sensibilidad al oxígeno varía, por lo cual existen diferentes formas de cultivarlos:
1)       En tubos,  con siembra en punción y con una capa de Vas-par (Vaselina – Parafina). A veces, se fluidifica el medio por calentamiento para sacar todo el O2 (en realidad, de esta manera se disminuye la solubilidad del O2, por ej. el medio Tioglicolato).
2)       Jarra de anaerobiosis: quita todas las trazas de O2. El aire se sustituye por H2 y CO2 en presencia de un catalizador que consume el O2. Se coloca un indicador que vira de color en presencia de O2.
3)       Cámaras especiales que insuflan N2 ó H2, totalmente selladas y con guantes insertos para manipular.

Cultivo puro (Axénico)
Es un concepto teórico. Es un cultivo de un único tipo de microorganismo que se obtiene a partir de una única célula.

Colonia

Población de células que puede observarse microscópicamente, y que crecen en un medio sólido, procedentes de una sola célula.


















No hay comentarios:

Publicar un comentario