TRANSGENICOS PARA EL CONTROL DE FITOPATOGENOS

Expresión de proteínas antifúngicas de otros organismos

• Se expresó el gen del hongo micoparasítico Trichoderma harzianum que codifica una quitinasa de potente actividad antifúngica en plantas de Nicotiana tabacum y Solanum tuberosum, obteniéndose resistencia al patógeno Rhizoctonia solani.
• Se expresó un gen sintético que codifica un péptido análogo al de magainina (producido por el anfibio Xenopus laevis). Su actividad antimicrobiana estaría dada por la interacción con las membranas de los microorganismos. Dado que dicha interacción estaría mediada por la interacción entre cargas, la composición de las membranas lipídicas sería la responsable de la especificidad de estos péptidos. Una vez en contacto con la membrana, tras alcanzar una concentración mínima el efecto antimicrobiano se daría por la apertura de poros en la membrana, con la consiguiente pérdida de osmolitos, o por la desestabilización de la membrana al variar su composición durante el pasaje de los péptidos de un lado a otro de la misma. El gen fue introducido en el genoma de cloroplastos mediante técnicas de biobalística y se logró su expresión sin afectar la función de las organelas., presumiblemente debido a las diferencias en la composición de las membranas de la misma respecto de las membranas bacterianas típicas. 

Expresión de genes relacionados con la regulación de la respuesta frente a patógenos

• Sobrexpresión de genes cuyos productos participan de la transducción de señales en los mecanismos de defensa . A diferencia de los genes R o de los elicitores, muchos de estos componentes intervienen en la regulación de diversos tipos de respuesta, posibilitando la activación de una batería más compleja de genes. Como ejemplo citaremos al gen NPR1 de Arabidopsis thaliana, que interviene en la transducción de señales de varios genes R, en la Respuesta Sistémica Adquirida y en la activación de señales promovidas por etileno o ácido jasmónico.
• Estudios recientes demostraron que la sobrexpresión del gen NPR1 en Arabidopsis parasitica y arroz aumenta la resistencia a patógenos. Significativamente, esta resistencia se logró sin pérdidas substanciales de rendimiento. Esto se debe probablemente a que las plantas transgénicas para NPR1 no expresan sus defensas constitutivamente, sino que parecen estar “preparadas” para responder a patógenos que normalmente superarían las defensas en las plantas no transgénicas.

Estrategias para obtener resistencia. Activación general de las defensas de la planta

• Una alternativa para desencadenar en las plantas las respuestas de defensa, especialmente la Respuesta Hipersensible, es la expresión de elicitores. Reciben este nombre aquellos compuestos que pueden iniciar en la planta una Respuesta Hipersensible localizada similar a la que provocaría el patógeno del que proviene. En muchos casos los elicitores o las proteínas que los producen se corresponden con el gen de avirulencia de un par R-avr. En otros casos, puede tratarse de compuestos de degradación de la pared vegetal o de la pared del hongo. Algunos elicitores pueden incluso generar respuestas de defensa en especies que no son atacadas por el patógeno correspondiente. Una planta que exprese un elicitor frente a la presencia del patógeno, o incluso antes de su llegada, podría iniciar una respuesta más rápida y eficaz que la planta sin transformar. Por supuesto, para que esta estrategia resulte efectiva la especie modificada debe ser capaz de reconocer al elicitor. En principio sería conveniente también el uso de un promotor inducible por el patógeno, ya que la expresión constitutiva de un elicitor podría dar lugar a un fenotipo lession mimic. Sin embargo, Tepfer et al. lograron resistencia a Phytophthora en tabaco mediante la expresión constitutiva del elicitor b-criptogeína, sin observar efectos adversos.

Estrategias para obtener resistencia. Transformación con genes de resistencia

• Las plantas pueden activar un efectivo arsenal de defensas inducidas contra los patógenos. Estas defensas incluyen la muerte celular programada de las células infectadas (la llamada Respuesta Hipersensible; HR), el refuerzo de tejidos por endurecimiento de las paredes celulares, y la producción de compuestos antifúngicos en el sitio de infección. A su vez, estas respuestas inician una respuesta sistémica de más larga duración (Resistencia Sistémica Adquirida o SAR) que previene a la planta contra ataques subsecuentes del mismo u otros patógenos. Dado que estas respuestas requieren una sustancial inversión de componentes celulares, todas las defensas se mantienen bajo un ajustado control genético y sólo se activan frente a la presencia del patógeno. La activación es posible gracias a la expresión de un amplio rango de genes R (genes de resistencia) que interaccionan con los productos de los genes Avr (genes de avirulencia) presentes en el patógeno. Los genes R codifican posibles receptores de los productos resultantes de los genes Avr del patógeno. En muchos casos, un solo gen R, al ser transferido a una variedad susceptible, puede conferir resistencia a una o más cepas del mismo patógeno. Debido a esto, los genes R se han utilizado en el mejoramiento tradicional durante décadas.
• La resistencia mediada por genes R presenta varias características atractivas para el control de enfermedades. Cuando es inducida en el momento y por el período preciso, las respuestas iniciadas pueden detener eficientemente el proceso de infección con un daño mínimo para la planta. Sin embargo, debe remarcarse que su uso como genes para conferir resistencia se limita a aquellas especies o variedades relacionadas con la original portadora del gen, puesto que se requiere la presencia en la planta de toda la cadena de transducción de señales acoplada al producto del gen R. Desafortunadamente, el monocultivo de variedades portadoras de un gen R determinado puede llevar rápidamente a la aparición de cepas de patógenos resistentes. Muchos productos de los genes R sólo confieren resistencia a un número limitado de cepas y, por lo tanto, su espectro de acción es parcial. En la historia de la agricultura moderna, esto ha derivado en la ocurrencia de “ciclos” durante los cuales un gen R introducido en una variedad determinada pierde efectividad al aumentar el área cultivada con el mismo y al aumentar consecuencia la presión de selección sobre la población de patógenos. Estos ciclos tienen una duración aproximada de 8 a 12 años. En este contexto, la introgresión de genes R por métodos tradicionales resulta un proceso lento que dura aproximadamente lo mismo que estos ciclos. 
• Dada la situación descripta, no es aconsejable el monocultivo de variedades portando un solo gen de resistencia. Dentro de las prácticas agrícolas tradicionales, una alternativa es la siembra conjunta de más de una variedad, cada una portando distintos genes de resistencia, lo que permite disminuir la presión de selección sobre la población de patógenos. El inconveniente de este enfoque es que también se aumenta la heterogeneidad de caracteres de interés agronómico (tiempos de desarrollo, rendimiento, etc.), por lo que baja la rentabilidad del cultivo. El uso de plantas transgénicas propone alternativas viables frente a estos problemas. El breve lapso requerido para introducir un determinado gen R mediante transgénesis hace posible la aparición de “variedades” que resultan isogénicas excepto en el gen introducido. De esta manera, se puede proceder al cultivo de múltiples variedades sin que haya variaciones en otras características de la planta. Otra opción, que insumiría más tiempo, es la introducción de múltiples genes R en una misma variedad. Esta estrategia, conocida como “apilamiento” (pyramiding o stacking) de genes R, es también aplicable.
• La característica de los genes R de conferir resistencia a variedades susceptibles puede utilizarse para identificarlos y clonarlos utilizando técnicas de ingeniería genética.

Estrategias para obtener resistencia. Modulación de la respuesta oxidativa

• El peróxido de hidrógeno (H₂O₂) cumple varias funciones en los procesos de defensa de la planta. Una vez detectada la presencia de un posible patógeno, los niveles de H₂O₂ aumentan drásticamente en el sitio de infección debido a la acción de una NADPH oxidasa aún no caracterizada. El peróxido presenta en sí mismo un efecto tóxico sobre los microorganismos, y es capaz de participar en reacciones de cross-linking entre las proteínas de la pared celular. Este compuesto está también involucrado en la activación de ciertas enzimas como las peroxidasas, que participan en el proceso de lignificación de la pared, o la ácido benzoico dihidrogenasa, que aumenta los niveles de ácido salicílico y también en la activación de las respuestas de tipo sistémico en la planta. Por otra parte, el H₂O₂ es uno de los factores que lleva al proceso de muerte celular local que forma parte de la Respuesta Hipersensible.

• A partir de la dilucidación del rol del H₂O₂ en las respuestas defensivas de las plantas, varios laboratorios han procurado obtener niveles elevados del mismo a fin de aumentar la resistencia a patógenos. Este incremento podría lograrse introduciendo genes que generen H₂O₂  o disminuyendo los niveles de las enzimas detoxificadoras, tales como catalasa o ascorbato peroxidasa. Sin embargo, es preciso tener en cuenta que la concentración de H₂O₂ debe mantenerse dentro de un rango que no sea tóxico para las células vegetales. De las diversas estrategias empleadas, la más exitosa hasta el momento parece haber sido la expresión de genes de glucosa-oxidasa. Se ha observado también un aumento de la expresión de proteínas de defensa a nivel sistémico en plantas transgénicas deficientes en catalasa.

• La sobrexpresión de glucosa oxidasa como estrategia para obtener resistencia a patógenos ha sido desarrollada principalmente en el laboratorio del Dr. D. Shah. Expresando un gen de glucosa oxidasa aislado del hongo Aspergillus niger en plantas de Solanum tuberosum, se observó un notable incremento de resistencia a los hongos Phytophthora infestans, Verticillium dahliae y a la bacteria Erwinia carotovora. Esta resistencia no se debería a un efecto directo del H₂O₂ sobre los patógenos, sino a una activación de las respuestas de defensa sistémicas. En estos estudios, el gen se expresó bajo el promotor 35S del Figworth mosaic virus y las plantas transgénicas no presentaban diferencias fenotípicas con las no transformadas. Contrastando con estos resultados, la expresión de una glucosa oxidasa proveniente del hongo Talaromyces flavus en tabaco, dirigida por un promotor de peroxidasa inducible por patógenos, resultó en la aparición de lesiones necróticas en las hojas maduras. Este tipo de fenotipo, conocido como lession mimic, puede darse cuando la regulación de la Respuesta Hipersensible ha sido alterada.

Estrategias para obtener resistencia. Interferencia con la patogénesis

• Si se conoce lo suficiente de la relación entre un patógeno y su planta hospedadora y sobre los mecanismos por los cuales dicho patógeno invade la planta, es posible desarrollar resistencia interfiriendo con el proceso de la patogénesis sin modificar los componentes de defensa de la misma. Entre las enzimas secretadas por los hongos para penetrar la pared celular del tejido blanco están las endo- y exo-polygalacturonasas (PGs), las pectato liasas y glucanasas. Se ha propuesto que las proteínas capaces de inhibir estas actividades enzimáticas forman parte de las defensas de la planta, impidiendo la penetración del hongo. El rol que cumplen las proteínas inhibidoras de poligalacturonasas (PGIPs) es doble: a) reducen la degradación de la pared celular vegetal, retrasando o impidiendo la penetración de los patógenos; b) producen, en lugar de los monómeros de ácido galacturónico que generan las PGs, una degradación incompleta con liberación de oligogalacturónidos. Estos compuestos sirven de elicitores y activan las respuestas defensivas.

• La producción de ácido oxálico se ha asociado con la patogenicidad de varias cepas de Sclerotinia sclerotiorum, Sclerotinia rolfsii y Sclerotinia ceptivorum. El papel exacto de esta molécula durante la infección no está bien estudiado. Durante los primeros estadios de la infección, y en las zonas marginales de la lesión, el oxalato podría interactuar en sinergismo con enzimas pectolìticas o celulolíticas. Dado que el oxalato es un potente quelante, podría quelar el calcio del pectato de calcio en la pared celular del huesped, causando la maceración del tejido vegetal. La importancia del ácido oxálico en la patogénesis ha sido demostrada en mutantes de S. Sclerotium incapaces de producir ácido oxálico. Estas mutantes no resultaron patogénicas en ensayos con Phaseolus vulgaris y Arabidopsis thaliana. 

• La regulación de la muerte celular es a menudo crucial en el desarrollo de las interacciones planta-patógeno, ya sean compatibles o incompatibles. La naturaleza puntual de estos procesos, los que pueden darse aún en una única célula, implican la existencia de señales específicas y procesos bioquímicos autónomos en cada célula. En animales, la muerte celular programada (PCD) o su equivalente morfológico, la apoptósis, son casos de suicidio celular programado. Aunque la Rrespuesta Hipersensible se asemeja a la PCD, el grado de similitud entre ambos procesos a nivel bioquímico y regulatorio no ha sido completamente aclarado. En Uromyces vignae la Respuesta Hipersensible ocurre acompañada de la degradación del ADN del hospedador, un evento común durante la PCD. Para investigar las similitudes entre ambos procesos, se observaron los efectos de genes inhibidores de apoptosis, entre ellos, Bcl-2 y Bcl-xl humanos, CED-9 de nematodos, Op-IAP y p35 de baculovirus La interferencia observada en la Respuesta Hipersensible tiene como consecuencia un aumento de la resistencia a hongos necrotróficos, los que posiblemente utilizan los propios procesos de muerte celular de la planta durante el proceso de infección.

• Los resultados de un trabajo en el que se introdujo resistencia antifúngica apoyándose en los conceptos expuestos en la transparencia anterior. Se expresó el gen antiapoptótico p35 de baculovirus en plantas de tomate en forma constitutiva. El producto de este gen inhibe específicamente una clase de cisteín-proteasas denominadas caspasas, las que están involucradas en el clivaje de varios sustratos importantes para la homeostasis celular. El mecanismos último por el cual el gen p35 inhibe el proceso apoptótico es motivo de activa investigación. La expresión del gen aumentó la resistencia de las plantas frente a los patógenos necrotróficos Alternaria alternata, Colletotrichum coccodes, y Pseudomonas syringae pv. tomato. En el caso de A. alternata, se conoce que la patogenicidad es determinada principalmente por la toxina AAL, la que inhibe a la enzima ceramida sintetasas y, por mecanismos aún no dilucidados, promueve la muerte celular. Se observó resistencia a niveles de esta toxina en las raíces de las plantas transformadas unas 30 veces superiores a las los tolerados por las plantas control.