jueves, 1 de enero de 2015

SSF: FERMENTACIÓN EN ESTADO SOLIDO (PARTE I)

La Fermentación en estado sólido (SSF ) se define como la   fermentación involucrando sólidos en ausencia (o casi ausencia ) de agua libre. Sin embargo, el sustrato debe poseer suficiente humedad para apoyar el crecimiento y el metabolismo del microorganismo.

SSF ofrece numerosas oportunidades en el procesamiento de residuos agroindustriales.

Esto es en parte porque el proceso de estado sólido tienen   requisitos más bajos de energía y producen menor aguas     residuales y son respetuosos del medio ambiente , ya que    resuelven  el problema de la eliminación de los desechos     sólidos.

 Un vistazo a la historia de la tecnología de fermentación   indica que los procesos SSF estaban casi completamente
 ignorados en los países occidentales después de 1940     debido a la adaptación de tecnología de fermentación           sumergida (SMF). 

Desde el desarrollo de la penicilina que tuvo lugar en SmF   se convirtió en el modelo a seguir para la tecnología de  las   fermentaciones


Aspectos generales de la SSF 


 Una aplicación de SSF es la producción de alimentos enriquecidos  en proteína para el ganado, que involucra la utilización de residuos agroindustriales ( agrega de valor a éstos  residuos de  bajo costo y en cierta medida contaminantes ambientales).

 De hecho , esta fue una de las áreas que generó interés de
 los investigadores a nivel mundial sobre la SSF. 

 Un gran número de patentes y publicaciones han aparecido asociadas a SSF, en desarrollo de bioreactores (fermentadores), modelado y producción de diversos productos microbianos tales como  alimentos, metabolitos secundarios y a bioprocesos como
 biolixiviación , biopulping , biorremediación , etc.

Estos incluyen la selección de microorganismos adecuados y sustrato, la optimización de los parámetros del proceso y el aislamiento y la purificación del producto. 

A juzgar por la clasificación teórica, sobre la base de la baja 
actividad acuosa, sólo los hongos y levaduras eran
apropiados como microorganismos adecuados para la SSF. 
Se pensaba que debido a la alta exigencia de actividad 
acuosa, los cultivos bacterianos no podrían ser adecuado
 para SSF. Sin embargo, la experiencia ha demostrado que
 los cultivos bacterianos pueden ser bien manejados y
 manipulado para procesos SSF. 

 La selección de un sustrato adecuado es otro aspecto clave de SSF.

 En SSF, el material sólido no es soluble y actúa tanto como soporte físico y fuente de nutrientes. El material sólido podría ser un sustrato sólido de origen natural tales como cultivos 
agrícolas, residuos agroindustriales o soportes inertes.

 Los soportes inertes deben ser embebidos con una solución de nutrientes de forma tal que se conserve la baja actividad
 acuosa y la alta transferencia de oxigeno.
  En relación a la selección de sustrato, podría haber dos
 principales consideraciones:

 La primera es actuar sobre un sustrato especifico para agregarle valor o aprovechar un residuo contaminante (el fin puede ser eliminar este sustrato).

 La segunda podría estar relacionado con el objetivo de producir un determinado producto de un sustrato adecuado. 
En este último caso, es necesario ensayar diversos sustratos y seleccionar el más adecuado.

 Los materiales inertes han sido utilizados a menudo
 para el estudio de modelización o de otros aspectos fundamentales de SSF.

Otros temas relevantes aquí podrían ser la selección de
parámetros del proceso y su optimización, estos incluyen
parámetros físico químicos y bioquímicos, tales como tamaño de  partículas, la humedad inicial, el pH y  
pre tratamiento del sustrato, la humedad relativa, la temperatura de incubación, agitación y aireación, la edad y el tamaño del inóculo, la suplementación de nutrientes como el N, P y oligoelementos, la suplementación de la fuente y los inductores de carbono adicional, extracción de producto y su purificación, etc. 


En los últimos años, han aparecido varios informes 
proporcionando una gran cantidad de conocimientos y comprensión de la aspectos fundamentales de la SSF y hoy se tiene mucha mas información sobre los efectos del calor y de transferencia de masa en procesos de SSF, que han sido consideradas como las principales dificultades en el manejo de sistemas SSF.  Sin embargo, todavía queda mucho por hacer en este sentido. 

Durante SSF, se genera una gran cantidad de calor, que es directamente proporcional a la las actividades metabólicas del microorganismo. Los materiales sólidos / matrices utilizadas para SSF tienen baja conductividad térmica,
por lo tanto, la eliminación de calor del proceso puede ser muy lento.

A veces la acumulación de calor es alto, lo que desnaturaliza
el producto formado y acumulado en el lecho, pudiendo haber un incremento de 20ºC por encima de la temperatura de incubación.  

 En las primeras fases de la SSF, la temperatura
y la concentración de oxígeno permanece uniforme en todo
el sustrato pero a medida que la fermentación progresa se genera calor y su transferencia está estrechamente relacionado con la aireación del sistema de fermentación. la temperatura del sustrato también es muy crítico en la SSF, ya que en última instancia afecta el crecimiento del microorganismo, la formación de esporas, la germinación, y la formación de producto.

Las altas humedades producen una disminución de la porosidad del sustrato,  impidiendo la penetración de oxígeno. Esto puede ayudar a la contaminación bacteriana.

Por otro lado, el bajo contenido de humedad puede conducir
a la mala accesibilidad de nutrientes produciendo un crecimiento microbiano malo.

En SSF las relaciones hídricas son criticas. La actividad acuosa(aw) del sustrato tiene una influencia determinante en
la actividad microbiana. En general, el tipo de microorganismo que puede crecer en los sistemas SSF se determinan por aw. 

La aw del medio es un parámetro fundamental para la transferencia de masa del agua y solutos a través de
las células microbianas. El control de este parámetro es utilizado para modificar la producción metabólica o la excreción de un microorganismo.

Modelado en SSF


Modelar SSF es otro aspecto importante, que necesita ser estudiado en detalle.  La poca información disponible en la cinética de las reacciones en los sistemas de SSF, se debe a la dificultad en las mediciones de los parámetros de crecimiento, el análisis del crecimiento celular y la determinación del consumo de sustrato, causado por su naturaleza heterogénea.

El uso de un sustrato sintético es una de las soluciones para hacer frente a este problema. 

Es bien sabido que la cinética de fermentación es sensible a la variación en la composición del gas ambiente e interno. El crecimiento de la biomasa puede ser determinada 
midiendo el cambio en la composición gaseosa dentro del
biorreactor. 

Otra posibilidad es la medición de glucosamina, el contenido de proteína, la tasa de consumo de oxígeno y la evolución de dióxido de carbono


Diseño de un biorreactor en SSF

Durante la última década, ha habido una mejora significativa
en la comprensión de cómo diseñar, operar y hasta escalar
biorreactores SSF.
 La clave de estos avances ha sido la aplicación de técnicas de modelado matemático para describir diversos fenómenos fisicoquímicos y bioquímicos dentro del sistema.

 El principio básico de la SSF es el lecho del sustrato solido.
 Este lecho contiene los sólidos húmedos y una fase hueca entre partículas. 

SSF ha sido convencionalmente más aplicable a hongos filamentosos, que crecen en la superficie de la partícula y penetran a través de la partícula entre los espacios en la profundidad del lecho.

 El proceso en la mayoría de los casos es de naturaleza aeróbica. 

El diseño soñado del biorreactor  debe superar los efectos del calor y de transferencia de masa, asimismo tiene que permitir la fácil de difusión y la extracción de los metabolitos.

 Si bien los fermentadores de tambores y de bandejas se han estudiado y utilizado desde hace mucho tiempo, el enfoque de los últimos años ha sido el desarrollo de fermentadores de lecho ya que podrían proporcionar una mejor economía de proceso y una mayor facilidad de manejo.


Las tendencias actuales en SSF se han centrado en la aplicación de SSF para el desarrollo de bioprocesos tales como la biorremediación y la biodegradación de compuestos peligrosos, biológicos, desintoxicación de residuos agroindustriales, biotransformación de los cultivos.

 Conclusiones

Se han producido avances significativos en la tecnología SSF en los últimos años. Varios enfoques han sido
aplicado para resolver los problemas relacionados con aspectos de la ingeniería bioquímica, que incluyen la cinética, modelado matemático, diseño de biorreactores, control avanzado de los sistemas de procesos SSF. 

El modelado podría ser una buena herramienta para los estudios de escalado pero tales resultados deben ser validados por los resultados experimentales.



 Por lo tanto, los esfuerzos continuos serían necesario para desarrollar la tecnología SSF como variable para la producción de productos microbianos en escala comercial  equivalente a la fermentación líquida.

viernes, 26 de diciembre de 2014

AGUA CALIDAD FARMACÉUTICA / ALIMENTICIA : MUESTREO Y ANÁLISIS


El análisis de las muestras de aguas, es muy importante, sobre todo en aquellas empresas que disponen de una planta de tratamiento, y recirculación del agua,  que sería lo correcto. El resultado de dichos análisis debe reflejar el buen funcionamiento de la purificación del agua, y demás tratamientos.
Dependiendo del uso que se le dará al agua, se clasifica, según USP y disposiciones del ANMAT en:
Agua corriente (de red)
Agua purificada
Agua destilada

MUESTREO

El muestreo debe realizarse según el procedimiento vigente de la empresa.

Es muy importante realizar el muestreo de manera  aséptica ya que de lo contrario, el análisis posterior de la muestra es invalidado.
El objetivo principal es no contaminar la muestra, por lo que  se deben tomar ciertas precauciones:
La muestra debe mantenerse refrigerada hasta el momento del análisis, para evitar la proliferación de los microorganismos.
En el caso de una salida de agua común, se debe sanitizar con alcohol 70º, o con solución de hipoclorito de sodio.
Luego purgar, de ser posible, en un balde, aproximadamente, 20 litros.
En el caso de que la salida de agua sea difícil de alcanzar, puede utilizarse una manguera estéril.
De la misma forma, si la salida de agua se utiliza con una manguera, debe muestrearse a la salida de la misma. No deberá retirarse, ya que la muestra de agua debe ser representativa del agua de uso cotidiano.
Los envases a utilizar deben estar estériles.
El analista que toma la muestra deberá usar guantes estériles, y de ser necesario, paños estériles.
Para aguas potables, utilizar algún neutralizante del cloro, como tiosulfato de sodio, por ejemplo.



AGUAS DE RED O CORRIENTE

ASPECTO
Liquido incoloro, transparente, inodoro.
Libre de partículas extrañas.

TECNICA MICROBIOLOGICA
CONTROL HIGIENICO DE AGUAS
MATERIALES NECESARIOS

v      recipiente estéril de 500 ml de capacidad, aproximadamente
v      portafiltros para filtración, estériles
v      embudos y filtros de vidrio o plástico estériles
v      membranas estériles de nitrato de celulosa (NC), de no más de 45 µm de poro, de 47 mm de diámetro
v      pipetas de 10ml y de 1 ml, estériles
v      ansas estériles descartables, o de metal
v      tubos de ensayo estériles con 10 ml de caldo Mc Conkey de doble concentración, y campanita de Durham invertida
v      tubos de ensayo estériles con 10 ml de caldo Mc Conkey de simple concentración, y campanita de Durham invertida
v      placas de petri estériles con 15-20 ml de TSA
v      placas de petri estériles con 15-20 ml de Cetrimide
v      placas de petri estériles con 15-20 ml de EMB-Levine
v      placas de petri estériles con 15-20 ml de agar P
v      placas de petri estériles con 15-20 ml de agar F
v      placas de petri estériles con 15-20 ml de agar Fluorocult
v      tubo/frasco Schott con tapa estéril con 100 ml de Caldo Lactosado
v      tubo/frasco Schott con tapa estéril con 100 ml de Caldo TSB (optativo, ya que puede reemplazarse por el Caldo Lactosado)
v      Frascos con tapa estériles con 400 ml de solución de Tiosulfato de sodio 0.5%
v      Frascos con tapa con solución de lavado tipo Peptona, o PLP, o similar, estériles
v      Pinzas estériles
v      Balde para purga de puntos

PROCEDIMIENTO

RECUENTO DE MICROORGANISMOS AEROBIOS TOTALES

Ø      Preparar el dispositivo filtrante con una membrana estéril de no más de 45 µm de poro, de NC de 47 mm de diámetro
Ø      Filtrar 10 ml de la muestra
Ø      Enjuagar la membrana con 3 porciones de 100 ml c/u, de solución de Tiosulfato de sodio, 0.5%
Ø      Retirar la membrana con una pinza estéril, y colocarla en una placa de TSA, con la precaución de colocar el lado donde se recogieron las bacterias durante el filtrado, hacia arriba. Además, no deben quedar burbujas entre la membrana y el agar
Ø      Repetir el procedimiento, pero filtrando una solución formada por 1 ml de muestra suspendido en 30 ml de solución de lavado
Ø      Incubar las placas sin invertir en estufa de 30-35 ºC +/- 2 ºC, durante 48 hs
Ø      Luego de la incubación, contar la cantidad de colonias obtenidas, que se desarrollaron en la superficie de la membrana
Ø      Si ambas placas tienen un recuento muy alto, y no puede realizarse fácilmente, repetir utilizando diluciones sucesivas de la muestra
Ø      Informar UFC/ml


INVESTIGACION DE Pseudomonas aeruginosa y Escherichia coli

Ø      Luego de realizar la filtración para el recuento, colocar una membrana nueva en el dispositivo filtrante
Ø      Filtrar 200 ml de muestra
Ø      Lavar con 3 porciones de 100 ml cada una, de solución de Tiosulfato de sodio, 0.5%
Ø      Colocar la membrana en el Caldo Lactosado
Ø      Repetir, y colocar en el frasco con Caldo TSB
Ø      Incubar preferentemente a 35ºC +/- 2ºC (sino, puede usarse la misma estufa que para aerobios totales)

INVESTIGACION DE Pseudomonas aeruginosa

Ø      Luego de 48 hs de incubación, si no se observa turbidez por desarrollo en el Caldo Lactosado, informar Ausencia de Pseudomonas aeruginosa
Ø      Si se observa turbidez en el Caldo Lactosado, repicar con ansa descartable estéril o ansa metálica esterilizada a la llama, sobre placa de agar Cetrimide.
Ø      Incubar invertida preferentemente a 35ºC +/- 2ºC (sino, puede usarse la misma estufa que para aerobios totales)
Ø      Luego de 48 hs de incubación, realizar la lectura de la placa: si no se observa desarrollo, Informar Ausencia de Pseudomonas aeruginosa
Ø      Si se observa desarrollo típico (colonias amarillo verdoso, con fluorescencia a la luz UV a 366 nm formadoras de pigmento verde azulado), continuar la marcha de identificación para Pseudomonas aeruginosa, mediante los siguientes ensayos:
o        Test de Oxidasa: colocar sobre las colonias sospechosas, tiras o discos de papel embebidos en solución de N,N-dimetil-p-fenildiamina al 1% en agua destilada. Las colonias positivas para este ensayo originan un color rosado que progresivamente se  transforma en púrpura oscura. Pseudomonas aeruginosa es OXIDASA POSITIVO
o        Formación de piocianina: repicar algunas de las colonias sospechosas sobre una placa de agar P, e incubar invertida preferentemente a 35ºC +/- 2ºC, durante 48-72 hs. Las colonias características que desarrolla la Pseudomonas aeruginosa en este agar, son amarillo-verdosas, con zonas de pigmentación azul difundida en el agar, correspondiente a la piocianina.
o        Formación de Fluoresceína: repicar algunas de las colonias sospechosas sobre una placa de agar F, e incubar invertida preferentemente a 35ºC +/- 2ºC, durante 48-72 hs. Las colonias características que desarrolla la Pseudomonas aeruginosa en este agar, son amarillentas con zonas de pigmentación amarilla y fluorescencia amarilla a verdosa a la luz UV (366 nm), correspondiente a la fluoresceína.
Ø      Si los 3 ensayos dan POSITIVOS, la probabilidad de que sea Pseudomonas aeruginosa es muy alta. Confirmar la identificación con API, o prueba similar

INVESTIGACION DE Escherichia coli

Ø      Luego de 48 hs de incubación, si no se observa turbidez por desarrollo en el Caldo Lactosado, informar Ausencia de Escherichia coli
(Si se utilizo el caldo TSB, la investigación se realiza basándose en este caldo)
Ø      Si se observa turbidez en el Caldo Lactosado (o Caldo TSB si corresponde), repicar con ansa descartable estéril o ansa metálica esterilizada a la llama, sobre placa de agar  EMB-Levine
Ø      Incubar invertida preferentemente a 35ºC +/- 2ºC (sino, puede usarse la misma estufa que para aerobios totales)
Ø      Luego de 48 hs de incubación, realizar la lectura de la placa: si no se observa desarrollo, Informar Ausencia de Escherichia coli
Ø      Si se observa desarrollo típico (colonias de 2-3 mm de diámetro, con brillo metálico verdoso a la luz reflejada y centro oscuro hasta negro con luz transmitida), continuar la marcha de identificación para Escherichia coli mediante el siguiente ensayo:
o        Agar Fluorocult: repicar algunas de  las colonias sospechosas, en agar Fluorocult. Incubar invertida preferentemente a 35ºC +/- 2ºC (sino, puede usarse la misma estufa que para aerobios totales). Si se observan colonias con fluorescencia al UV (366 nm), la probabilidad de que sea Escherichia coli es muy alta. Confirmar la identificación con API, o prueba similar

RECUENTO DE COLIFORMES POR NUMERO MAS PROBABLE (NMP)

Ø      Agregar 10 ml de muestra a 3 tubos de caldo MC Conkey doble concentración
Ø      Agregar 1 ml de muestra a 3 tubos de caldo MC Conkey  simple concentración
Ø      Agregar 0.1 ml de muestra a 3 tubos de caldo MC Conkey  simple concentración
Ø      Incubar los 9 tubos a 35ºC +/- 2ºC, junto con un tubo de cada concentración, sin muestra, como control negativo
Ø      Luego de la incubación, contar los tubos con producción de acido (visualizado por el viraje  de color violeta amarillo), y la formación de gas (visualizado por la formación de burbujas dentro de la campanita de Durham), y de acuerdo a la cantidad sembrada, comparar con la tabla de NMP, para determinar como resultado el número más probable en 100 ml de muestra (NMP/100 ml)


TABLA DE NMP/ml

NUMERO DE TUBOS POSITIVOS
MNP/100ml
LIMITE DE CONFIANZA (95%)
3 TUBOS (10 ml)
3 TUBOS (1 ml)
3 TUBOS (0,1 ml)
INFERIOR
SUPERIOR
0
0
1
3
0,5
9
0
1
0
3
0,5
13
1
0
0
4
0,5
20
1
0
1
7
1
21
1
1
0
7
1
23
3 TUBOS (10 ml)
3 TUBOS (1 ml)
3 TUBOS (0,1 ml)

INFERIOR
SUPERIOR
1
1
1
11
3
36
1
2
0
11
3
36
2
0
0
9
1
36
2
0
1
14
3
37
2
1
0
15
3
44
2
1
1
20
7
89
2
2
0
21
4
47
2
2
1
28
10
150
2
0
0
23
4
120
3
0
1
39
7
130
3
0
2
64
15
380
3
1
0
43
7
210
3
1
1
75
14
230
3
1
2
120
30
380
3
2
0
93
15
380
3
2
1
150
30
440
3
2
2
210
35
470
3
3
0
240
36
1300
3
3
1
460
71
2400
3
3
2
1100
150
4800

ESPECIFICACIONES MICROBIOLOGICAS

NIVEL DE ACCION

Recuento de aerobios totales: 100 UFC/ml
Recuento de coniformes totales: >3 UFC/100ml
Ausencia de patógenos:
Pseudomonas aeruginosa: presencia/200 ml
Escherichia coli: presencia/200 ml

AGUA PURIFICADA

ASPECTO
Liquido incoloro, transparente, inodoro.
Libre de partículas extrañas.

TECNICA MICROBIOLOGICA
CONTROL HIGIENICO DE AGUAS

MATERIALES NECESARIOS:
IDEM AGUA DE RED

PROCEDIMIENTO

RECUENTO DE MICROORGANISMOS AEROBIOS TOTALES

Ø      Preparar el dispositivo filtrante con una membrana estéril de no más de 45 µm de poro, de NC de 47 mm de diámetro
Ø      Filtrar 10 ml de la muestra
Ø      Enjuagar la membrana con 3 porciones de 100 ml c/u, de peptona, PLP o solución de lavado similar
Ø      Retirar la membrana con una pinza estéril, y colocarla en una placa de TSA, con la precaución de colocar el lado donde se recogieron las bacterias durante el filtrado, hacia arriba. Además, no deben quedar burbujas entre la membrana y el agar
Ø      Repetir el procedimiento, pero filtrando una solución formada por 1 ml de muestra suspendido en 30 ml de solución de lavado
Ø      Incubar las placas sin invertir en estufa de 30-35 ºC +/- 2 ºC, durante 48 hs
Ø      Luego de la incubación, contar la cantidad de colonias obtenidas, que se desarrollaron en la superficie de la membrana
Ø      Informar UFC/ml

INVESTIGACION DE Pseudomonas aeruginosa y Escherichia coli

IDEM AGUA DE RED

INVESTIFACION DE Pseudomonas aeruginosa

IDEM AGUA DE RED

INVESTIFACION DE Escherichia coli

IDEM AGUA DE RED

ESPECIFICACIONES MICROBIOLOGICAS

NIVEL DE ALERTA

Recuento de aerobios totales: 10 UFC/ml

NIVEL DE ACCION

Recuento de aerobios totales: 100 UFC/ml
Ausencia de patógenos:
Pseudomonas aeruginosa: presencia/200 ml
Escherichia coli: presencia/200 ml

AGUA DESTILADA

ASPECTO
Liquido incoloro, transparente, inodoro.
Libre de partículas extrañas.

TECNICA MICROBIOLOGICA
CONTROL HIGIENICO DE AGUAS

MATERIALES NECESARIOS:

IDEM AGUA DE RED

PROCEDIMIENTO

RECUENTO DE MICROORGANISMOS AEROBIOS TOTALES

Ø      Preparar el dispositivo filtrante con una membrana estéril de no más de 45 µm de poro, de NC de 47 mm de diámetro
Ø      Filtrar 100 ml de la muestra
Ø      Enjuagar la membrana con 3 porciones de 100 ml c/u, de peptona, PLP, o polución de lavado similar
Ø      Retirar la membrana con una pinza estéril, y colocarla en una placa de TSA, con la precaución de colocar el lado donde se recogieron las bacterias durante el filtrado, hacia arriba. Además, no deben quedar burbujas entre la membrana y el agar.
Ø      Incubar la placa sin invertir en estufa de 30-35 ºC +/- 2 ºC, durante 48 hs
Ø      Luego de la incubación, contar la cantidad de colonias obtenidas, que se desarrollaron en la superficie de la membrana.
Ø      Informar UFC/100 ml



INVESTIGACION DE Pseudomonas aeruginosa y Escherichia coli

IDEM AGUA DE RED

INVESTIFACION DE Pseudomonas aeruginosa

IDEM AGUA DE RED

INVESTIFACION DE Escherichia coli

IDEM AGUA DE RED

ESPECIFICACIONES MICROBIOLOGICAS

NIVEL DE ALERTA

Recuento de aerobios totales: 3 UFC/100 ml

NIVEL DE ACCION

Recuento de aerobios totales: 10 UFC/100 ml
Ausencia de patógenos:
Pseudomonas aeruginosa: presencia/200 ml
Escherichia coli: presencia/200 ml