El análisis de las muestras de aguas, es muy
importante, sobre todo en aquellas empresas que disponen de una planta de
tratamiento, y recirculación del agua,
que sería lo correcto. El resultado de dichos análisis debe reflejar el
buen funcionamiento de la purificación del agua, y demás tratamientos.
Dependiendo del uso que se le
dará al agua, se clasifica, según USP y disposiciones del ANMAT en:
Agua corriente (de red)
Agua purificada
Agua destilada
MUESTREO
El muestreo debe realizarse según el procedimiento vigente
de la empresa.
Es muy importante realizar el muestreo de manera aséptica ya que de lo contrario, el análisis
posterior de la muestra es invalidado.
El objetivo principal es no contaminar la muestra, por lo
que se deben tomar ciertas precauciones:
La muestra debe mantenerse refrigerada hasta el momento del
análisis, para evitar la proliferación de los microorganismos.
En el caso de una salida de agua común, se debe sanitizar
con alcohol 70º, o con solución de hipoclorito de sodio.
Luego purgar, de ser posible, en un balde, aproximadamente,
20 litros.
En el caso de que la salida de agua sea difícil de alcanzar,
puede utilizarse una manguera estéril.
De la misma forma, si la salida de agua se utiliza con una
manguera, debe muestrearse a la salida de la misma. No deberá retirarse, ya que
la muestra de agua debe ser representativa del agua de uso cotidiano.
Los envases a utilizar deben estar estériles.
El analista que toma la muestra deberá usar guantes
estériles, y de ser necesario, paños estériles.
Para aguas potables, utilizar algún neutralizante del cloro,
como tiosulfato de sodio, por ejemplo.
AGUAS DE RED O CORRIENTE
ASPECTO
Liquido incoloro, transparente, inodoro.
Libre de partículas extrañas.
TECNICA MICROBIOLOGICA
CONTROL
HIGIENICO DE AGUAS
MATERIALES NECESARIOS
v
recipiente estéril de 500 ml de
capacidad, aproximadamente
v
portafiltros para filtración,
estériles
v
embudos y filtros de vidrio o
plástico estériles
v
membranas estériles de nitrato de
celulosa (NC), de no más de 45 µm de poro, de 47 mm de diámetro
v
pipetas de 10ml y de 1 ml, estériles
v
ansas estériles descartables, o de
metal
v
tubos de ensayo estériles con 10 ml
de caldo Mc Conkey de doble concentración, y campanita de Durham invertida
v
tubos de ensayo estériles con 10 ml
de caldo Mc Conkey de simple concentración, y campanita de Durham invertida
v
placas de petri estériles con 15-20
ml de TSA
v
placas de petri estériles con 15-20
ml de Cetrimide
v
placas de petri estériles con 15-20
ml de EMB-Levine
v
placas de petri estériles con 15-20
ml de agar P
v
placas de petri estériles con 15-20
ml de agar F
v
placas de petri estériles con 15-20
ml de agar Fluorocult
v
tubo/frasco Schott con tapa estéril
con 100 ml de Caldo Lactosado
v
tubo/frasco Schott con tapa estéril
con 100 ml de Caldo TSB (optativo, ya que puede reemplazarse por el Caldo
Lactosado)
v
Frascos con tapa estériles con 400
ml de solución de Tiosulfato de sodio 0.5%
v
Frascos con tapa con solución de
lavado tipo Peptona, o PLP, o similar, estériles
v
Pinzas estériles
v
Balde para purga de puntos
PROCEDIMIENTO
RECUENTO DE MICROORGANISMOS AEROBIOS
TOTALES
Ø
Preparar el dispositivo filtrante
con una membrana estéril de no más de 45 µm de poro, de NC de 47 mm de diámetro
Ø
Filtrar 10 ml de la muestra
Ø
Enjuagar la membrana con 3 porciones
de 100 ml c/u, de solución de Tiosulfato de sodio, 0.5%
Ø
Retirar la membrana con una pinza
estéril, y colocarla en una placa de TSA, con la precaución de colocar el lado
donde se recogieron las bacterias durante el filtrado, hacia arriba. Además, no
deben quedar burbujas entre la membrana y el agar
Ø
Repetir el procedimiento, pero
filtrando una solución formada por 1 ml de muestra suspendido en 30 ml de
solución de lavado
Ø
Incubar las placas sin invertir en
estufa de 30-35 ºC +/- 2 ºC, durante 48 hs
Ø
Luego de la incubación, contar la
cantidad de colonias obtenidas, que se desarrollaron en la superficie de la
membrana
Ø
Si ambas placas tienen un recuento
muy alto, y no puede realizarse fácilmente, repetir utilizando diluciones
sucesivas de la muestra
Ø
Informar UFC/ml
INVESTIGACION DE Pseudomonas
aeruginosa y Escherichia coli
Ø
Luego de realizar la filtración para
el recuento, colocar una membrana nueva en el dispositivo filtrante
Ø
Filtrar 200 ml de muestra
Ø
Lavar con 3 porciones de 100 ml cada
una, de solución de Tiosulfato de sodio, 0.5%
Ø
Colocar la membrana en el Caldo
Lactosado
Ø
Repetir, y colocar en el frasco con
Caldo TSB
Ø
Incubar preferentemente a 35ºC +/-
2ºC (sino, puede usarse la misma estufa que para aerobios totales)
INVESTIGACION DE Pseudomonas
aeruginosa
Ø
Luego de 48 hs de incubación, si no
se observa turbidez por desarrollo en el Caldo Lactosado, informar Ausencia de Pseudomonas
aeruginosa
Ø
Si se observa turbidez en el Caldo
Lactosado, repicar con ansa descartable estéril o ansa metálica esterilizada a
la llama, sobre placa de agar Cetrimide.
Ø
Incubar invertida preferentemente a
35ºC +/- 2ºC (sino, puede usarse la misma estufa que para aerobios totales)
Ø
Luego de 48 hs de incubación,
realizar la lectura de la placa: si no se observa desarrollo, Informar
Ausencia de Pseudomonas aeruginosa
Ø
Si se observa desarrollo típico
(colonias amarillo verdoso, con fluorescencia a la luz UV a 366 nm formadoras
de pigmento verde azulado), continuar la marcha de identificación para Pseudomonas
aeruginosa, mediante los siguientes ensayos:
o
Test de Oxidasa: colocar
sobre las colonias sospechosas, tiras o discos de papel embebidos en solución
de N,N-dimetil-p-fenildiamina al 1% en agua destilada. Las colonias positivas
para este ensayo originan un color rosado que progresivamente se transforma en púrpura oscura. Pseudomonas
aeruginosa es OXIDASA POSITIVO
o
Formación de piocianina: repicar
algunas de las colonias sospechosas sobre una placa de agar P, e incubar
invertida preferentemente a 35ºC +/- 2ºC, durante 48-72 hs. Las colonias
características que desarrolla la Pseudomonas aeruginosa en este
agar, son amarillo-verdosas, con zonas de pigmentación azul difundida en el
agar, correspondiente a la piocianina.
o
Formación de Fluoresceína: repicar
algunas de las colonias sospechosas sobre una placa de agar F, e incubar
invertida preferentemente a 35ºC +/- 2ºC, durante 48-72 hs. Las colonias
características que desarrolla la Pseudomonas aeruginosa en este
agar, son amarillentas con zonas de pigmentación amarilla y fluorescencia
amarilla a verdosa a la luz UV (366 nm), correspondiente a la fluoresceína.
Ø
Si los 3 ensayos dan POSITIVOS, la
probabilidad de que sea Pseudomonas aeruginosa es muy
alta. Confirmar la identificación con API, o prueba similar
INVESTIGACION DE Escherichia
coli
Ø Luego de 48 hs de incubación, si no se observa turbidez por desarrollo
en el Caldo Lactosado, informar Ausencia de Escherichia
coli
(Si se utilizo el caldo TSB, la
investigación se realiza basándose en este caldo)
Ø
Si se observa turbidez en el Caldo
Lactosado (o Caldo TSB si corresponde), repicar con ansa descartable estéril o
ansa metálica esterilizada a la llama, sobre placa de agar EMB-Levine
Ø
Incubar invertida preferentemente a
35ºC +/- 2ºC (sino, puede usarse la misma estufa que para aerobios totales)
Ø Luego de 48 hs de incubación, realizar la lectura de la placa: si no se
observa desarrollo, Informar Ausencia de Escherichia
coli
Ø
Si se observa desarrollo típico
(colonias de 2-3 mm de diámetro, con brillo metálico verdoso a la luz reflejada
y centro oscuro hasta negro con luz transmitida), continuar la marcha de
identificación para Escherichia coli mediante
el siguiente ensayo:
o
Agar Fluorocult: repicar algunas
de las colonias sospechosas, en agar
Fluorocult. Incubar invertida preferentemente a 35ºC +/- 2ºC (sino, puede
usarse la misma estufa que para aerobios totales). Si se observan colonias
con fluorescencia al UV (366 nm), la probabilidad de que sea Escherichia
coli es muy alta. Confirmar la identificación con API, o prueba
similar
RECUENTO DE COLIFORMES POR NUMERO MAS PROBABLE (NMP)
Ø
Agregar 10 ml de muestra a 3 tubos
de caldo MC Conkey doble concentración
Ø
Agregar 1 ml de muestra a 3 tubos de
caldo MC Conkey simple concentración
Ø
Agregar 0.1 ml de muestra a 3 tubos
de caldo MC Conkey simple concentración
Ø
Incubar los 9 tubos a 35ºC +/- 2ºC,
junto con un tubo de cada concentración, sin muestra, como control negativo
Ø
Luego de la incubación, contar los
tubos con producción de acido (visualizado por el viraje de color violeta 
amarillo), y la formación de gas (visualizado
por la formación de burbujas dentro de la campanita de Durham), y de acuerdo a
la cantidad sembrada, comparar con la tabla de NMP, para determinar como
resultado el número más probable en 100 ml de muestra (NMP/100 ml)
amarillo), y la formación de gas (visualizado
por la formación de burbujas dentro de la campanita de Durham), y de acuerdo a
la cantidad sembrada, comparar con la tabla de NMP, para determinar como
resultado el número más probable en 100 ml de muestra (NMP/100 ml)
TABLA DE NMP/ml
|
NUMERO DE TUBOS POSITIVOS
|
MNP/100ml
|
LIMITE DE CONFIANZA (95%)
|
|||
|
3 TUBOS (10 ml)
|
3 TUBOS (1 ml)
|
3 TUBOS (0,1 ml)
|
INFERIOR
|
SUPERIOR
|
|
|
0
|
0
|
1
|
3
|
0,5
|
9
|
|
0
|
1
|
0
|
3
|
0,5
|
13
|
|
1
|
0
|
0
|
4
|
0,5
|
20
|
|
1
|
0
|
1
|
7
|
1
|
21
|
|
1
|
1
|
0
|
7
|
1
|
23
|
|
3 TUBOS (10 ml)
|
3 TUBOS (1 ml)
|
3 TUBOS (0,1 ml)
|
|
INFERIOR
|
SUPERIOR
|
|
1
|
1
|
1
|
11
|
3
|
36
|
|
1
|
2
|
0
|
11
|
3
|
36
|
|
2
|
0
|
0
|
9
|
1
|
36
|
|
2
|
0
|
1
|
14
|
3
|
37
|
|
2
|
1
|
0
|
15
|
3
|
44
|
|
2
|
1
|
1
|
20
|
7
|
89
|
|
2
|
2
|
0
|
21
|
4
|
47
|
|
2
|
2
|
1
|
28
|
10
|
150
|
|
2
|
0
|
0
|
23
|
4
|
120
|
|
3
|
0
|
1
|
39
|
7
|
130
|
|
3
|
0
|
2
|
64
|
15
|
380
|
|
3
|
1
|
0
|
43
|
7
|
210
|
|
3
|
1
|
1
|
75
|
14
|
230
|
|
3
|
1
|
2
|
120
|
30
|
380
|
|
3
|
2
|
0
|
93
|
15
|
380
|
|
3
|
2
|
1
|
150
|
30
|
440
|
|
3
|
2
|
2
|
210
|
35
|
470
|
|
3
|
3
|
0
|
240
|
36
|
1300
|
|
3
|
3
|
1
|
460
|
71
|
2400
|
|
3
|
3
|
2
|
1100
|
150
|
4800
|
ESPECIFICACIONES
MICROBIOLOGICAS
NIVEL DE ACCION
Recuento de aerobios totales: 100 UFC/ml
Recuento de coniformes totales: >3 UFC/100ml
Ausencia de patógenos:
Pseudomonas aeruginosa:
presencia/200 ml
Escherichia coli: presencia/200 ml
AGUA PURIFICADA
ASPECTO
Liquido incoloro, transparente, inodoro.
Libre de partículas extrañas.
TECNICA MICROBIOLOGICA
CONTROL
HIGIENICO DE AGUAS
MATERIALES NECESARIOS:
IDEM AGUA DE RED
PROCEDIMIENTO
RECUENTO DE
MICROORGANISMOS AEROBIOS TOTALES
Ø
Preparar el dispositivo filtrante
con una membrana estéril de no más de 45 µm de poro, de NC de 47 mm de diámetro
Ø
Filtrar 10 ml de la muestra
Ø
Enjuagar la membrana con 3 porciones
de 100 ml c/u, de peptona, PLP o solución de lavado similar
Ø
Retirar la membrana con una pinza
estéril, y colocarla en una placa de TSA, con la precaución de colocar el lado
donde se recogieron las bacterias durante el filtrado, hacia arriba. Además, no
deben quedar burbujas entre la membrana y el agar
Ø
Repetir el procedimiento, pero
filtrando una solución formada por 1 ml de muestra suspendido en 30 ml de
solución de lavado
Ø
Incubar las placas sin invertir en
estufa de 30-35 ºC +/- 2 ºC, durante 48 hs
Ø
Luego de la incubación, contar la
cantidad de colonias obtenidas, que se desarrollaron en la superficie de la
membrana
Ø
Informar UFC/ml
INVESTIGACION
DE Pseudomonas aeruginosa y Escherichia coli
IDEM AGUA DE RED
INVESTIFACION
DE Pseudomonas aeruginosa
IDEM AGUA DE RED
INVESTIFACION
DE Escherichia coli
IDEM AGUA DE RED
ESPECIFICACIONES
MICROBIOLOGICAS
NIVEL DE ALERTA
Recuento de aerobios totales: 10 UFC/ml
NIVEL DE ACCION
Recuento de aerobios totales: 100 UFC/ml
Ausencia de patógenos:
Pseudomonas aeruginosa:
presencia/200 ml
Escherichia coli: presencia/200 ml
AGUA DESTILADA
ASPECTO
Liquido incoloro, transparente, inodoro.
Libre de partículas extrañas.
TECNICA MICROBIOLOGICA
CONTROL
HIGIENICO DE AGUAS
MATERIALES NECESARIOS:
IDEM AGUA DE RED
PROCEDIMIENTO
RECUENTO
DE MICROORGANISMOS AEROBIOS TOTALES
Ø
Preparar el dispositivo filtrante
con una membrana estéril de no más de 45 µm de poro, de NC de 47 mm de diámetro
Ø
Filtrar 100 ml de la muestra
Ø
Enjuagar la membrana con 3 porciones
de 100 ml c/u, de peptona, PLP, o polución de lavado similar
Ø
Retirar la membrana con una pinza
estéril, y colocarla en una placa de TSA, con la precaución de colocar el lado
donde se recogieron las bacterias durante el filtrado, hacia arriba. Además, no
deben quedar burbujas entre la membrana y el agar.
Ø
Incubar la placa sin invertir en
estufa de 30-35 ºC +/- 2 ºC, durante 48 hs
Ø
Luego de la incubación, contar la
cantidad de colonias obtenidas, que se desarrollaron en la superficie de la
membrana.
Ø
Informar UFC/100 ml
INVESTIGACION
DE Pseudomonas aeruginosa y Escherichia coli
IDEM AGUA DE RED
INVESTIFACION
DE Pseudomonas aeruginosa
IDEM AGUA DE RED
INVESTIFACION
DE Escherichia coli
IDEM AGUA DE RED
ESPECIFICACIONES
MICROBIOLOGICAS
NIVEL DE ALERTA
Recuento de aerobios totales: 3 UFC/100 ml
NIVEL DE ACCION
Recuento de aerobios totales: 10 UFC/100 ml
Ausencia de patógenos:
Pseudomonas aeruginosa:
presencia/200 ml
Escherichia coli: presencia/200 ml
