Aspectos fundamentales de la Fermentación
Estequeométrico:
ÞLa concentración final de células (Biomasa) y productos de fermentación depende de la concentración y composición del medio de cultivo y del balance de materia y energía de los procesos de crecimiento celular
Cinético:
Þ velocidad en la que se desarrolla el proceso
En la estequeometría de producción de masa celular (biomasa) consideramos al crecimiento de un organismo como una reacción química. Por lo tanto se pueden formular ecuaciones y realizar el balance de esa ecuaciones.
Fuente de C + Fuente de N + O2 + minerales + nutrientes específicos ------------> Masa celular (Biomasa) + Productos + CO2 + H2O + Calor
En la estequeometría de producción de masa celular (biomasa) consideramos al crecimiento de un organismo como una reacción química. Por lo tanto se pueden formular ecuaciones y realizar el balance de esa ecuaciones.
Fuente de C + Fuente de N + O2 + minerales + nutrientes específicos ------------> Masa celular (Biomasa) + Productos + CO2 + H2O + Calor
Formación de productos
- Asociado al crecimiento
- Semiasociado al crecimiento
- No asociado al crecimiento
Tiempo Tiempo Tiempo
Un medio de cultivo necesita tener fuente de carbono y energía (sustrato), fuente de nitrógeno, Macroelementos, Microelementos y oxigeno. La ecuación da como resultado biomasa, productos del metabolismo primario/secundario, dióxido de carbono, agua y calor
Composición de los medios de cultivo
Para realizar el cálculo estequeométrico es necesario conocer la composición elemental de un microorganismo, sino se conoce puede tomarse la fórmula promedio que es igual a:
de tal modo es posible calcular cuanto pesa un carbono mol de biomasa:
1 C-mol de biomasa es igual
12 + 1.79+ 16*0.5 + 14*0.2 = 25.8 g
0.95
De forma análoga se puede definir:
•1 C-mol de fuente de carbono y energía: cantidad de fuente de carbono y energía que contiene 1 átomo gramo de carbono.
•1 C-mol de producto:cantidad de producto que contiene 1 átomo gramo de carbono.
La aplicación de la estequeometría requiere conocer los rendimientos, que se definen como el cociente entre el producto obtenido y el sustrato consumido.
Balance de materia
El coeficiente de respiración RQ, moles de CO2 producidos por moles de O2 consumidos, permite resolver estas 4 ecuaciones con 5 incógnitas y hallar el valor de los coeficientes a, b, c, d, e :
Valores de RQ
S. cerevisieae = 1,033 (glucosa)
S cerevisieae = 0,43 (hexadecano)
Yx/s = c-moles de biomasa formada
Por cada c-mol de fuente de
C y E
Donde s x y s s es la fracción de carbono en la biomasa y en el sustrato
respectivamente. s x suele ser una constante para de valor de 0.465
Ejemplo: Determinación de los coeficientes estequiométricos para el crecimiento aerobio de Saccharomyces cerevisieae sobre glucosa
BALANCES
Definiciones:
El crecimiento individual procariota continúa hasta que se divide en nuevas células, es decir la fisión binaria. Durante el ciclo, todos los constituyentes celulares se incrementan en número y la célula hija recibe un cromosoma completo y copias de moléculas, monómeros e iones.
El crecimiento
poblacional es el aumento en el número de células
de una población, lo que puede medirse como aumento de la masa microbiana.
La velocidad
de crecimiento es el cambio en el número de células o
masa celular por unidad de tiempo.
El tiempo
de generación es el tiempo requerido para que a
partir de una célula se formen dos células.
Crecimiento exponencial
El modelo de incremento de la población
en el que el número de células se dobla cada cierto período de tiempo se conoce
como Crecimiento Exponencial.
Cuando esto se representa en ejes de
escala aritmética, se obtiene una curva característica en la cual se va
incrementando progresivamente la pendiente. Una característica que me indica
que el crecimiento es exponencial es que la velocidad de incremento en el
número de células es lenta inicialmente, para después incrementar
constantemente en una explosión.
Para obtener mejor información se
utiliza una escala logarítmica (en base 10) para el número de células. Esta
función es una recta, que además puede usarse como evidencia que el crecimiento
microbiano es exponencial.
Ciclo de crecimiento de poblaciones
En un recipiente cerrado conocido como
cultivo en “batch” (cultivo discontínuo), donde el medio no se renueva, ocurre
una típica curva de crecimiento, la cual detallaremos a continuación:
- Fase
de Latencia:
Cuando
una población microbiana se inocula en medio fresco, no ocurre crecimiento
inmediatamente, sino después de un cierto tiempo que se llama Fase de Latencia,
cuya duración depende de varios factores. Si un cultivo en crecimiento
exponencial se inocula exactamente en el mismo medio, no se observa esta fase.
Sin embargo si el inóculo se toma a partir de un cultivo viejo, entonces tiene
lugar una fase de adaptación, incluso si todas las células presentes en el
inóculo son viables. Esto ocurre porque las células, en estas condiciones,
carecen de determinados componentes esenciales y tiene que transcurrir un
cierto tiempo para que se proceda a su síntesis.
También
se requiere una fase de latencia cuando las células han sido dañadas o cuando
se transfieren de un medio rico a un medio pobre.
- Fase
exponencial:
Es la
consecuencia de que una célula se divida en dos, estas en otras dos, y así
sucesivamente. La velocidad es influenciable por las condiciones ambientales y
las características genéticas.
- Fase
estacionaria:
En un
cultivo donde no se renueva el medio, el crecimiento exponencial no puede
ocurrir indefinidamente lo que habitualmente sucede es que, o bien un nutriente
esencial del medio de cultivo se acaba, o algún producto de desecho se acumula
en el medio hasta alcanzar concentraciones inhibitorias del crecimiento
exponencial.
En
esta fase no hay incremento neto del número de células, sin embargo, aunque en
esta fase no tiene lugar el crecimiento, todavía ocurren muchas funciones
celulares, incluyendo el metabolismo energético.
Algunos
microorganismos pueden tener un crecimiento lento, es decir algunas células
crecen y otras mueren, siendo el balance total ausencia de incremento en el
número de células. Este fenómeno se conoce como Crecimiento Críptico.
- Fase
de muerte:
Si la
incubación continúa después que la población alcanzó la fase estacionaria, las
células deben permanecer vivas y metabólicamente activas, pero también deben
morir. En algunos casos la muerte va acompañada de lisis celular, sin embargo
en muchos casos, la velocidad de muerte es mucho menor que la de crecimiento.
Medición del crecimiento:
Existen
diversos métodos para contar el número de células.
-
Contaje
total de células:
Se
mide directamente al microscopio, en una cámara de New Bauer. Es una manera
rápida de estimar el número de células. Tiene limitaciones:
1)
Las
células muertas no se distinguen de las vivas.
2)
Las
células pequeñas son difíciles de ver.
3)
Se
requiere tiempo y habilidad.
4)
Es
poco preciso con suspensiones de concentraciones menores a 106
células /ml.
-
Recuento
de viables:
Una
célula viable se define como la que es capaz de dividirse para dar lugar a
descendencia.
Hay
dos maneras de llevar a cabo un recuento en placa:
1)
Por
siembra en superficie.
2)
Por
siembra en profundidad (o vertido en placa)
En el
método de siembra en superficie, un volumen no mayor de 0.1 ml de la
dilución apropiada se extiende por toda la superficie del medio utilizando una
barra de vidrio doblada estéril (espátula de Drigalsky). Es importante que la
superficie del medio esté bien seca de modo que el líquido sea absorbido
rápidamente.
En el
método de siembra en profundidad, se pipetea un volumen conocido (0.1 a 1.0 ml
) de la dilución y se coloca en la placa. Luego se coloca el medio de cultivo
fundido previamente y termostatizado a 40-45 ºC, se mezcla y se deja
solidificar. El microorganismo que vaya a ser contado debe resistir la
temperatura del medio.
-
Medidas
de masa y turbidez:
Se
puede medir la masa celular neta por centrifugación de un volumen
conocido y simplemente pesar el precipitado. El procedimiento habitual es
determinar el peso seco después de secar las muestras durante 12 horas a 90-110
ºC. la masa seca de las células bacterianas es aproximadamente entre el 10 y 20
% de la masa húmeda.
Un
método más útil es la medición de turbidez. Una suspensión celular
aparece turbia porque las células dispersan la luz que atraviesa la suspensión.
Cuantas más células haya, más luz se dispersa y más turbia aparece la
suspensión. La turbidez puede medirse con un fotómetro o espectrofotómetro.
Para
organismos unicelulares, las medidas de unidades fotométricas (DO), son
proporcionales, dentro e ciertos límites, al número de células. Por lo tanto
las medidas de turbidez pueden utilizarse como un sustituto para otros métodos
de conteo.
Cultivo continuo :
Un
cultivo continuo es esencialmente un cultivo de volumen constante, al que se le
añade medio fresco y del que rebosa medio usado con células.
El
tipo más común de cultivo continuo es el llamado Quimiostato, que
permite el control de la densidad de la población y la velocidad de crecimiento
del cultivo. Se usan dos elementos en el control del quimiostato: la velocidad
de dilución y la concentración de un nutriente limitante, tal como la fuente de
carbono o de nitrógeno.
En el
quimiostato la densidad poblacional se controla por la concentración del
nutriente limitante presente en el reservorio, y la velocidad de crecimiento se
controla por la velocidad de salida.
Efectos de factores ambientales sobre el crecimiento
v
Temperatura:
Para cada microorganismo hay una
temperatura mínima por debajo de la cual no existe el crecimiento, una
temperatura óptima en donde el crecimiento es el más rápido posible (está más
cercana de la máxima que de la mínima) y una temperatura máxima por encima de
la cual no existe crecimiento.
Los microorganismos se clasifican según
su temperatura óptima de crecimiento en:
-
Psicrófilos:
crecen a temperaturas bajas. Rango entre 10 hasta -20 ºC, con una temperatura
óptima de 15ºC.
-
Mesófilos:
crecen a temperaturas ambientes. Rango entre 10 y 45ºC, con una temperatura
óptima de 20 – 40 ºC.
-
Termófilos:
crecen a temperaturas altas. Rango entre 25 y 80 ºC, con una temperatura óptima
de 50 – 60 ºC.
-
Termófilos
extremos: crecen a temperaturas muy altas. Rango entre 80 y 110 ºC.
Temperaturas bajas
Existen también microorganismos
psicrotoletantes que son los crecen a 0 ºC, pero su temperatura óptima de
crecimiento es de 20 – 40 ºC. Éstos tienen enzimas que funcionan igual aún a
bajas temperaturas, y su membrana posee una mayor cantidad de ácidos grasos
insaturados que permiten que siga siendo una estructura semifluida a pesar de
la temperatura. Durante la congelación de las células, conviene agregar
líquidos solubles en agua como el glicerol y el dimetilsulfóxido al 10 %, los
cuales protegen a la célula previniendo la formación de cristales dentro de
ella.
Temperaturas altas
Algunos microorganismos tienen enzimas
estables al calor, las cuales son proteínas estables debido a cambios que
tienen en algunos de sus aminoácidos, y además tienen otro plegamiento.
Los microorganismos hipertermófilos
tienen además una formación de puente de sal y un empaquetamiento altamente
hidrofóbito.
v
pH
Según su tolerancia a los distintos pH,
los microorganismos se clasifican en:
-
Acidófilos:
crecen a pH externos bajos, entre 1 y 5, mientras que su pH interno es de 6.5.
los hongos tienden a ser más tolerantes.
-
Neutrófilos:
crecen a pH externos cercanos a la neutralidad, entre 5.5 y 8.5, mientras que
su pH interno es de 7.5. En este grupo entran la mayoría de los
microorganismos.
-
Alcalófilos:
crecen a pH externos altos, entre 9 y 10, mientras que su pH interno es de 9.5.
La mayoría son del género Bacillus.
v
Disponibilidad de agua
El agua disponible se mide en términos
físicos: aw (Actividad de agua): p/po (relación entre la presión de vapor de la solución
con respecto a la del agua pura).
Nos indica la cantidad de moléculas de
agua que están disponibles para ser utilizadas por el microorganismos (o sea
que no están ligadas a algún soluto que las esté reteniendo).
Cuando el microorganismo se encuentra
en un medio donde el balance de agua es positivo, el agua entra a la célula.
Por otro lado, cuando el microorganismo se encuentra en un medio o solución con
baja actividad de agua (por ej. una solución de sal ó de azúcar), la célula
pierde agua y se produce plasmólisis (la célula se lisa).
Los microorganismos se clasifican en:
-
Halófilos:
microorganismos que viven en altas concentraciones de sales,
tienen grandes requerimientos de
Cloruro de Sodio.
-
Osmófilos:
microorganismos que viven en altas concentraciones de
azúcares.
-
Xerófilos:
microorganismos que viven en ambientes muy secos.
v
Potencial de Oxido – Reducción:
Es una medida de la tendencia que posee
el medio de donar ó ceder electrones. Es crítico para el crecimiento y está
asociado con el Oxígeno (O2) disuelto que es muy oxidante para las
células.
Según los requerimientos de Oxígeno,
los microorganismos se clasifican en:
- Aerobios:
- Estrictos: Necesitan del O2
para crecer, en niveles atmosféricos (21%). Hacen respiración aeróbica.
- Microaerófilos: Requieren de oxígeno para
crecer, pero a niveles más bajos que los atmosféricos (1 - 15 %), debido a
que tienen limitada capacidad de hacer respiración aeróbica ó sus enzimas
son sensibles al oxígeno.
- Anaerobios:
- Estrictos: mueren
en presencia de oxígeno porque no tienen enzimas que degraden los
metabolitos del oxígeno. Realizan respiración anaerobia y fermentación.
- Facultativos:
pueden crecer con presencia o ausencia de oxígeno. Si hay oxígeno realizan
respiración aerobia ya que es más energética, sino hacen fermentación y
respiración anaeróbica.
- Aerotolerantes: Crecen en presencia de
oxígeno pero no lo utilizan. Realizan fermentación y respiración
anaeróbica.
Cuando
los cultivos microbianos son:
-
Aerobios
estrictos: como el oxígeno es poco soluble en agua y
es consumido por los microorganismos, estos cultivos crecen mejor en agitación,
tanto sea con aireación forzada o insuflando aire.
-
Microaerófilos
: se usa algún método para disminuir la presión de oxígeno.
-
Anaerobios:
su sensibilidad al oxígeno varía, por lo cual existen diferentes formas de
cultivarlos:
1)
En tubos, con siembra en punción y con una capa de
Vas-par (Vaselina – Parafina). A veces, se fluidifica el medio por
calentamiento para sacar todo el O2 (en realidad, de esta manera se
disminuye la solubilidad del O2, por ej. el medio Tioglicolato).
2)
Jarra de anaerobiosis:
quita todas las trazas de O2. El aire se sustituye por H2
y CO2 en presencia de un catalizador que consume el O2.
Se coloca un indicador que vira de color en presencia de O2.
3)
Cámaras especiales que
insuflan N2 ó H2, totalmente selladas y con guantes
insertos para manipular.
Cultivo
puro (Axénico)
Es un concepto teórico. Es un cultivo de un único tipo de
microorganismo que se obtiene a partir de una única célula.
Colonia
Población de células que puede observarse microscópicamente,
y que crecen en un medio sólido, procedentes de una sola célula.
